仔猪感染圆环病毒2型的检测与分析

李明波，雷彬，董斌科，梅书棋，陈明银，刘心建

摘要：通过PCR方法对湖北某试验猪场3份疑似患断奶仔猪衰竭综合征（PMWS）的仔猪和一份死胎样本进行检测，结果4份组织病料中均扩增到494 bp大小的PCV2-DNA片段，而伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）检测为阴性。对扩增产物进行测序和Blast同源性分析发现，所检测的PCV2病毒为PCV2b亚型，其ORF2基因全长为702 bp，与PCV2-WH株、PCV2-HB WH24毒株的核苷酸序列同源性分别为94%和99%。通过试验研究，明确了该试验猪场猪群中保育仔猪的主要感染病原为PCV2，为更好地应用疫苗防控该病和研究综合控制技术提供了依据。

关键词：猪圆环病毒2型;ORF2基因;检测与分析

中图分类号：S858.28        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5798-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.044

猪圆环病毒病（PCV2）是由圆环病毒2型引起的一系列疾病的总称，包括断奶仔猪衰竭综合征（PMWS）、出生猪的先天震颤和生长猪的皮炎肾病综合征、增生性肠炎、青年母猪的流产及产死胎等。断奶仔猪衰竭综合征（PMWS）是临床较常见、造成经济损失较大的猪圆环病毒病，临床患PMWS的仔猪表现为皮肤苍白、呼吸道症状、进行性消瘦、腹股沟淋巴结肿大和生长发育不整齐，容易继发细菌感染等。PCV2对环境的抵抗力较强，可经猪的唾液、鼻腔、粪尿、乳汁、胎盘和公猪精液等途径传播。猪圆环病毒病严重影响了仔猪的生长性能，表现为养殖场内持续性感染，是其他猪病多发和频发的主要原因之一。

PCV2为环状、单股DNA病毒，由衣壳蛋白（Cap蛋白，由ORF2编码）和核酸组成（含1 767/1 768个核苷酸）[1]。研究表明世界范围内PCV2病毒的抗原决定簇核苷酸序列的同源性高达93%以上[2]。PCV2主要侵害猪的免疫系统，单核/巨噬细胞系（如肺泡巨噬细胞、树突状细胞等）是病毒感染猪后的靶细胞，可引起淋巴细胞数量减少及凋亡，造成免疫抑制，使感染猪的免疫应答作用降低。PCV2毒株可分为PCV2a/PCV2b基因亚型，根据对临床PCV2毒株的序列分析表明，PCV2b是当前国内猪群中的主要优势毒株，且PCV2b比PCV2a的毒力更强，这两个基因型间的不同仅存在ORF2之间的差异[3]。

临床上PCV2感染猪引起的病理变化主要是水肿，如间质性肺炎、淋巴结水肿、肠系膜水肿、心脏冠状沟的胶冻样水肿等，在炎症过程中体液或组织液的渗出是宿主感染病毒后的重要发展规律。患PMWS猪的临床症状则较为复杂，原因是PCV2常与其他因子协同致病从而加重病情，这些因子包括病原微生物（猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌等）、免疫佐剂和免疫调节剂药物（地塞米松）等[4]。本研究通过PCR方法对湖北某试验猪场3份疑似患断奶仔猪衰竭综合征（PMWS）的仔猪和一份死胎样本进行了检测，明确了该试验猪场猪群中保育仔猪的主要感染病原，旨在为该病的防控提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  病料来源  某试验原种场内临床疑似患PMWS的保育仔猪3头（50～60日龄）和死胎1头。发病仔猪临床症状：体温41～42 ℃，呼吸困难进而衰竭，进行性消瘦，皮肤苍白、被毛粗乱等。病理剖检变化：心包、胸膜等处有少量纤维素性蛋白渗出，胸腔积液，肺脏出血（部分组织出现肉变），腹股沟及肠系膜淋巴结肿大出血、切面呈苍白色，肾脏及胃黏膜均有出血点等。选取临床症状典型的病猪进行解剖，并采集肺脏组织、淋巴结等病料。

1.1.2  引物  参照文献[5]，根据GenBank中的PCV2-ORF2保守基因序列（编码病毒主要结构蛋白Cap蛋白）设计合成1对特异性引物，上游引物P1：5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物P2：5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′。检测伪狂犬野毒（PRV-gE基因）和猪繁殖与呼吸综合征经典和变异毒株（PRRSV-Nsp2基因）引物由华中农业大学动物传染病诊断中心实验室惠赠。

1.2  方法

1.2.1  PCR检测  从采集的病猪肺脏和淋巴结组织提取PCV2-DNA模板，再配置PCR反应体系（单重扩增）：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上、下游引物（10 mmol/L）各1 μL、模板4 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL、灭菌水14.35 μL，总反应体系25 μL。

将配好的样品放入PCR管进行扩增，退火温度为54 ℃。反应条件：94 ℃变性5 min;94 ℃30 s，54 ℃40 s，72 ℃45 s，共35个循环;72 ℃延伸10 min，扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

检测伪狂犬野毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物和技术方法由华中农业大学动物传染病诊断中心实验室提供。

1.2.2  产物测序和Blast比对  将扩增的ORF2-DNA产物回收，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并对测序的结果与GenBank上登录的PCV2病毒（包括疫苗株）相关序列进行Blast比对。

2  结果与分析

2.1  PCV2-ORF2基因的扩增和其他病原的检测结果

圆环病毒（PCV2）检测方法及判断标准：试验以圆环病毒的PCV2衣壳（Cap）蛋白为目的基因进行PCR扩增，能够从阳性模板中扩增出494 bp的片段。如果样品中有PCV2存在，则能够扩增出494 bp大小的条带。由图1可见，4份组织样品中均能扩增出494 bp大小的条带，表明4份组织样品中均能检测出PCV2。

由表1可见，4份组织（肺脏和淋巴结）样品中均可检测出PCV2，未检测出伪狂犬野毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒（经典和变异毒株）。

2.2  PCV2-ORF2基因的测序和Blast比对

将扩增的PCV2-ORF2基因克隆到pMD18-T质粒载体送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，其大小为702 bp，具体见图2。

将临床PCV2-ORF2基因序列与GenBnak中登录毒株PCV2-WH（PCV2b亚型，登录号FJ598044）和PCV2-HB WH24（PCV2b亚型，登录号FJ870971）用Blast软件比较其同源性，结果其同源性分别为94%和99%（图3）。

3  小结与讨论

猪圆环病毒（PCV2）的致病性与病毒感染剂量、母源抗体水平以及感染时的日龄有关。由于健康猪体内可携带病毒而不出现临床症状，运用荧光定量PCR技术对PMWS病猪和临床健康猪肠系膜淋巴结、血清样品中病毒DNA含量检测表明，每毫升血清或500 ng组织样品中PMWS病毒含量大于107，而健康猪小于106 [6]。因此，在发病猪的组织中，通常检出107拷贝的病毒DNA，这就要求实验室在病料定性检测为PCV2阳性时，仍需定量测定病毒含量。

本试验通过对临床患PMW品的病猪及死胎组织样品进行PCV2、PRV、PRRSV相关基因的PCR定性检测，结果表明：

1）该猪场临床PCV2毒株与疫苗毒株（PCV2-WH株）和湖北某地区另一分离毒株（PCV2-HB WH24株）有较高的同源性，而这两个毒株均为PCV2b基因亚型，病毒的DNA大小均为1 767 bp，从而推断PCV2b基因亚型为检测猪群的主要优势毒株。

2）3份已免疫PCV2灭活疫苗的保育猪组织样本中PCV2病毒PCR定性检测呈较强阳性，而死胎组织呈弱阳性，表明仔猪在某一阶段或出生前感染了病毒。虽然ORF2基因编码的Cap蛋白是PCV2良好的免疫蛋白，这也提示病毒ORF2基因内较小的差异可能造成疫苗毒对临床毒株不能起到良好保护效果。此外，PCV2灭活疫苗的临床免疫效果还与商品疫苗的抗原滴度大小、疫苗佐剂、免疫方式、猪只是否携带其他病原等因素密切相关。

3）该猪场引起保育猪发病的病原主要是PCV2，由于PCV2可引起机体免疫抑制，容易造成细菌继发感染副猪嗜血杆菌病、猪肺炎支原体、链球菌病等，在前期的试验研究中鉴定了该猪场引起副猪嗜血杆菌病的菌株血清型为2、4、13型，提示在防控PMWS和制定免疫程序时应该加强副猪嗜血杆菌病（HPS）疫苗和猪肺炎支原体疫苗的有效免疫，同时在断奶-保育仔猪阶段进行饲料给药预防控制是非常必要的（如大环内酯类药物、免疫增强剂、抗应激药物等）。

近年来，国内外研究者在PCV2的病原学、分子和临床致病机理、疫苗开发、免疫效果评价等方面开展并取得了较好的研究成果，使该病的临床发病率有效降低，提高了仔猪存活率和生产成绩。但仍有关于PCV2的未知毒力基因和其他病毒复制相关非结构蛋白的功能还不甚了解;同时，病毒与其他病原协同感染机制、免疫与感染的鉴别诊断技术、疫苗开发等方面需要进一步的探索和研究。

参考文献：

[1] 斯特劳，赵德明，张仲秋，等.猪病学[M].第九版. 北京：中国农业大学出版社，2008.313-318.

[2] LAROCHELLE R，MAGAR R，DALLAIRE S. Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2（PCV2）strains from cases presenting various clinical conditions[J]. Virus Res，2002，90：101-102.

[3] 刘  健，张维谊，鞠厚斌，等.猪圆环病毒2a/2b亚型病毒株毒力分析[J].中国畜牧兽医，2013，40（2）：23-27.

[4] 韦  平，秦爱建.重要动物病毒分子生物学[M].北京：科学出版社，2008.478-496.

[5] 李文洁，李文涛，严伟东，等.中国部分地区猪圆环病毒2型的基因型分析[J].畜牧兽医学报，2009，40（9）：1358-1362.

[6] BRUNBORG I M，MOLDAL T，JONASSEN C M.Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of healthy pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome using a TaqMan-based real-time PCR[J]. J Virol Methods， 2004，122（2）：171-178.