利用热带假丝酵母发酵处理玉米秸秆碱法制浆废液的研究

范金石，刘祝兵，管斌，*，孔青

（1.青岛科技大学化工学院，山东青岛266042；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

利用热带假丝酵母发酵处理玉米秸秆碱法制浆废液的研究

范金石1，刘祝兵1，管斌1，2*，孔青2

（1.青岛科技大学化工学院，山东青岛266042；2.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

以玉米秸秆碱法制浆废液为原料，对热带假丝酵母的培养条件进行了研究。菌种经过培养、驯化和优化，最终得出了处理废液的最佳发酵条件为发酵温度28℃、pH值5.5、发酵时间48 h、磷酸氢二钾1.5 g/L、硫酸镁1.0 g/L、接种量10%、摇床转速160 r/min、摇瓶装液量50 mL/250 mL，菌体生物量能达到8.583 g/L，化学需氧量（CODCr）去除率达到62.8%，生物需氧量（BOD5）去除率达到53.7%，为玉米秸秆碱法制浆废液资源化利用和降低废水排放量提供了新的途径。

玉米秸秆；碱法制浆废液；热带假丝酵母

造纸业是传统的用水大户，也是造成水污染的重要污染源之一。目前我国造纸工业废水排放量及化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）排放量均居我国各类工业排放量的首位，未经处理的废液中CODCr较高，由此带来的环境问题备受人们的关注[1]。碱法制浆废液中含有大量的有机物、氮（N）等营养成分，很多能为微生物利用。

热带假丝酵母（Candida tropialis）是酵母单细胞生物。它具有生长速度快、转化率高的优点，是目前最重要的微生物蛋白的来源之一[2]。利用热带假丝酵母发酵法处理高浓度玉米秸秆碱法制浆废液，既可降低废液化学耗氧量（CODCr）和生物耗氧量（biochemical oxygen demand，BOD5），又能生产微生物饲料—饲料酵母。

本研究利用热带假丝酵母发酵处理过滤后的玉米秸秆碱法制浆废液，探讨最佳玉米秸秆碱法制浆废液的生物污水处理工艺条件，旨在为热带假丝酵母处理废液并降低废水的COD和BOD提供依据。本研究考察培养基质成分调节以及发酵时间、培养液pH值和发酵温度等处理条件对处理玉米秸秆碱法制浆废液效果的影响，以期为玉米秸秆碱法制浆废液资源化利用和降低废水排放量提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

玉米秸秆：产于青岛市胶南；热带假丝酵母（Candida tropicalis）2.0637：中国微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基采用琼脂固体培养基：10°Bx麦芽汁，加2%的琼脂，pH 5.5，121℃灭菌20 min。。

种子培养基采用葡萄糖培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、麸皮浸出液（麸皮∶水=1∶10）100mL/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

驯化培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、麸皮浸出液（麸皮∶水=1∶10）100 mL/L，pH 5.5，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：玉米秸秆碱法制浆废液100 mL、葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、麸皮浸出液（麸皮∶水= 1∶10）100 mL/L、121℃灭菌20 min。

废液：取玉米秸秆500 g，NaOH 90 g，蒸馏水630 mL于高压蒸煮锅中，升温至140℃，蒸煮2 h后倒出物料，收集废液以备用。

1.1.3 化学试剂

NaOH、稀盐酸（0.1 mol/L HCl）、高锰酸钾（K2MnO4）、浓硫酸（98%H2SO4）、硫酸铜（CuSO4）、重铬酸钾（K2Cr2O7）、酒石酸钠、邻苯二甲酸氢钾（HOOCC6H4COOK）均为分析纯：临沂双润化工有限公司。

1.2 仪器与设备

ZQS1型电热蒸煮锅：陕西科技大学机械厂；AR213电子分析天平：上海奥豪斯国际贸易有限公司；HZQ-X100型振荡培养箱：东联电子技术开发有限公司；LDS-10B型离心机：北京雷博尔离心机有限公司；BCM-1000型超净工作台：苏净集团安泰公司；ZDX-35BI型自动灭菌锅：上海申安医疗器械厂；COD-571型化学需要量分析仪：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种培养方法

菌种活化：将菌种用接种环接入斜面培养基中，放入28℃的培养箱中培养36～48 h。

液体种子的制备：将斜面上生长良好的菌种制成悬浮液，用移液枪接入50mL种子培养基（装液量50mL/250mL）中，放到恒温摇床振荡培养48 h，备用。

摇床培养：将驯化后的菌种按10%接种量接入由碱法制浆废液（过滤后）组成的培养基中（装液量100 mL/250 mL），瓶口用8层纱布封好后，再放到恒温摇床上培养。

1.3.2 分析方法

废液pH值的测定：采用酸度计测定；废液密度、固形物含量、残碱的测定：根据文献[3]中方法进行测定；总糖及还原糖的测定[4]：斐林试剂热滴定法[5]；CODCr测定：重铬酸钾化学法[5]；BOD5测定：稀释接种法[6]。

1.3.3 菌体干质量的测定

发酵液经过4 000 r/min离心后所得菌体，用去离子水冲洗后，在100℃条件下烘干至质量恒定，称菌体质量（以绝干计），并测定发酵液其他各项指标。

1.3.4 蒸煮废液木质素脱除处理

取蒸煮废液500mL于烧杯，滴加足量稀硫酸（6 mol/L），静置24 h后，过滤，收集滤液，用于后期废液处理。

2 结果与分析

2.1 废液的制备及其主要成分

废液的成分与性质会直接影响菌体的发酵结果，因此对玉米秸秆碱法制浆废液主要成分进行了分析，结果如表1所示。从表1可看出，在秸秆碱法制浆废液的pH值为9.2，其中所含的糖类、有机碳等物质都是易为热带假丝酵母利用的营养成分，可作为微生物发酵处理的原料。

2.2 热带假丝酵母处理碱法制浆废液发酵工艺条件优化

2.2.1 磷源对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

微生物主要是从无机磷化物中获得磷，本实验在50 mL发酵培养基中添加磷酸氢二钾和磷酸氢二钠两种磷源（起始添加量均为1.5 g/L），考察磷源对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响，结果如图1所示。

从图1可看出，玉米秸秆碱法制浆废液不能为菌体的生长提供足够的磷。比较磷酸氢二钾和磷酸氢二钠作为磷源时的发酵结果，磷酸氢二钾添加量1.5 g/L时菌体干质量和CODCr、BOD5去除率均达到最大值，分别为8.564 g/L、62.5%、54.3%；磷酸氢二钠添加量1.5 g/L时菌体干质量和CODCr、BOD5去除率均达到最大值，分别为8.397g/L、59.4%、53.1%。所以，前者发酵效果较好。因此，选择磷酸氢二钾1.5 g/L为最佳磷源添加量。

2.2.2 氮源对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

酵母生长需要添加一定量的氮源，发酵液中氮源含量有限，本实验选择硝酸铵和硫酸铵两种常见的无机氮源，考察氮源对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响，发酵结果如图2所示。

从图2（A）可知，随着硝酸铵添加量的增加，发酵效果更加理想。当添加量为1.0 g/L时，菌体干质量和CODCr、BOD5去除率达到最大值，分别为8.639 g/L、63.2%、55.2%。由图2（B）可看出，硫酸铵对发酵效果影响较为缓和，添加量在0～2 g/L时，菌体干质量、CODCr、BOD5去除率逐渐升高，添加量＞2 g/L时，3个指标开始降低。可能的原因是发酵液中含有SO42-离子，抑制菌体生长，且硫酸铵添加量在2 g/L时，菌体干质量达到最大值为8.601 g/L，此时CODCr、BOD5去除率分别为62.5%、52.8%。结果表明，硝酸铵发酵效果优于硫酸铵，故选择硝酸铵1.0 g/L为最适氮源添加量。

2.2.3 无机盐对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

微生物在生长繁殖和生产过程中，需要某些无机盐作为微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物。本实验选择MgSO4和MnSO4两种无机盐添加到废液中，考察了无机盐对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响，结果如图3所示。

从图3（A）可知，MgSO4添加量为1.0 g/L时，发酵效果最好，CODCr、BOD5去除率分别能达到63.6%、55.1%，此时菌体干质量能达到8.655 g/L。由图3（B）可知，MnSO4添加量为1.0 g/L时，发酵结果较好，CODCr、BOD5去除率达到61.2%、53.8%，此时菌体干质量为8.413 g/L。结果表明，MnSO4发酵效果不如MgSO4。故选择MgSO41.0 g/L作为热带假丝酵母发酵的最佳无机盐添加量。

2.2.4 发酵时间对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

在培养液pH值为5.5，发酵温度28℃，接种量10%，摇床转速160 r/min的条件下，不同发酵时间下处理结果如图4所示。

由图4可看出，随着发酵时间的变化，菌体干质量和CODCr、BOD5去除率均随之变化。在0～48 h，菌种生长较为旺盛，菌体干质量和发酵液CODCr、BOD5去除率逐渐升高，当发酵时间在48 h时，菌体干质量和CODCr、BOD5去除率达到最高，分别为8.012 g/L、51.2%、48.7%；发酵时间＞48 h后，可能后期发酵液中有机物被消耗，菌种代谢缓慢，各指标逐渐下降，因此确定热带假丝酵母处理玉米秸秆碱法制浆废液的发酵时间为48 h。

2.2.5 发酵温度对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

在发酵时间48 h、培养液pH值5.5、接种量10%、摇床转速160 r/min、摇瓶装液量50 mL/250 mL的条件下，在不同发酵温度条件下进行发酵的结果见图5。

由图5可看出，温度对发酵结果影响较为显著。发酵温度在24～28℃时菌体快速生长，CODCr、BOD5去除率也逐渐上升。当温度＞28℃，菌体干质量和CODCr、BOD5去除率开始下降，说明温度过高不利于热带假丝酵母发酵生长。温度在28℃时菌体干质量达最大值为7.954 g/L，CODCr、BOD5去除率均达到最高值，分别为52.3%、41.8%，所以确定最佳发酵温度为28℃。

2.2.6 培养液pH值对菌体生长和CODCr、BOD5去除率的影响

在发酵时间48 h，发酵温度28℃、接种量10%、摇床转速160 r/min、摇瓶装液量50 mL/250 mL的条件下，不同培养液pH值下进行发酵的结果如图6所示。

由图6可看出，培养液pH值对菌种发酵的影响非常显著。pH值在5.0～6.5之间菌种生长较为良好，CODCr、BOD5去除率也有较好的效果。过高或过低的pH值不易于菌种发酵生长。当pH值为5.5时，菌体干质量达最大值7.944 g/L，发酵液CODCr、BOD5去除率达到最高值，分别为50.8%、43.7%，所以确定最适培养液pH值为5.5。

2.2.7 最佳条件下处理废液实验

通过探讨各因素（发酵时间、发酵温度、pH值、磷源、氮源和无机盐）对玉米秸秆碱法制浆废液处理结果的影响，确定热带假丝酵母处理玉米秸秆碱法制浆废液的最优条件为：发酵时间48 h、发酵温度28℃、pH值为5.5、磷酸氢二钾1.5 g/L、硝酸铵1.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L。

在优化条件下，热带假丝酵母对玉米秸秆制浆废液进行处理后，发酵液CODCr由原来的128 g/L下降至47.6 g/L，CODCr去除率达到62.8%，BOD5去除率为53.7%，为进一步处理玉米秸秆碱法制浆废液提供了一定的基础；同时热带假丝酵母在制浆废液中生长良好，菌体干质量达到8.583g/L。因此，利用热带假丝酵母处理玉米秸秆碱法制浆废液，可以达到废水生物处理和饲料酵母生产的双重目的。

2.3 发酵液成分分析

对热带假丝酵母在最佳条件下处理后的废液（发酵液）进行主要成分分析，结果如表2所示。

由表2可以看出，玉米秸秆碱法制浆废液经过热带假丝酵母处理后，废液中各主要成分含量均有不同程度的下降。其中以还原糖和CODCr下降最为明显，说明热带假丝酵母发酵需要消耗大量的糖，同时说明玉米秸秆碱法制浆废液中所含的碳、糖等能为热带假丝酵母的生长提供必要的营养成分，有利于其生长。另外，CODCr、BOD5较高的去除率，使发酵液检测指标达到国标3544—2001《造纸工业水污染物排放标准》中的相关规定，也为废水处理提供一种新途径。

3 结论

玉米秸秆碱法制浆废液中含有可供热带假丝酵母发酵所需的氮和糖类等营养成分，可用来发酵生产饲料酵母。

热带假丝酵母处理玉米秸秆碱法制浆废液的最佳工艺条件为发酵时间48 h、发酵温度28℃、pH值为5.5、接种量10%，摇床转速160 r/min，摇瓶装液量50 mL/250 mL。在此最佳条件下，菌体干质量8.583 g/L，CODCr去除率62.8%，BOD5去除率53.7%。

发酵后发酵液中的各主要成分与原废液相比均有不同程度的下降，热带假丝酵母对废液中的有机物和无机物利用能力较强，使处理发酵液达到国标3544—2001《造纸工业水污染物排放标准》污水排放标准，也为废水处理提供一种新途径。

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FAN Jinshi1,LIU Zhubing1,GUAN Bin1,2*,KONG Qing2
(1.College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science&Technology,Qingdao 266042,China; 2.College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Using alkaline pulping spent liquor of corn stalks as raw materials,theCandida tropicalcultivation conditions were studied.By strain cultivation,domestication and optimization,the optimum fermentation conditions of alkaline pulping spent liquor were obtained.The results indicated the optimal conditions were fermentation temperature 28℃,pH 5.5,time 48 h,K2HPO41.5 g/L,MgSO41.0 g/L,inoculum 10%,rotation speed 160 r/min, shake bottle volume 50 ml/250 ml.Under these conditions,the dry cell weight ofC.tropicalwas 8.583 g/L,removal rates of CODCrand BOD5were 62.8%and 53.7%,respectively.The method provided a new way to treat alkaline pulping spent liquor of corn stalks and to reduce the pollution of spent liquor.

corn stalks;alkaline pulping spent liquor;Candida tropialis

X793

A

0254-5071（2015）04-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.027

2015-03-05

青岛市公共领域科技支撑计划项目（11-2-3-63-nsh）；啤酒生物发酵工程国家重点实验室开放课题（K2012002）

范金石（1969-），男，副教授，博士，主要从事天然生物质资源开发与利用的研究工作。

*通讯作者：管斌（1957-），男，教授，博士，主要从事发酵工程方面的研究工作。