高产DHA裂壶藻突变株的选育

吕小义，付杰，尹佳，田华，陈涛，何东平*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023；2.中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉430071）

高产DHA裂壶藻突变株的选育

吕小义1，付杰1，尹佳1，田华1，陈涛2，何东平1*

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉430023；2.中国科学院武汉病毒研究所，湖北武汉430071）

利用60Co-γ射线辐照诱变裂壶藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888，以平板生长情况、生物量、含油率和二十二碳六稀酸（DHA）产量为综合指标，最终选育出一株高产突变株，命名为1.6-7-1，其摇瓶发酵生物量为47.37 g/L，油脂含量为31.41%，DHA产量为5.65 g/L，且DHA产量较出发菌株提高了约40%，经连续5代发酵培养，其遗传性能稳定。

60Co-γ射线；裂壶藻；二十二碳六烯酸

自世界卫生组织正式推荐婴幼儿生长发育的早期阶段要及时补充二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），其就以其独特的生理功能愈发成为人们关注的焦点[1-3]。近年来，DHA行业迅猛发展，产量逐年上升。因此开发高效低廉的DHA生产工艺不仅有助于改善目前DHA研发生产现状，更可以推广至其他多不饱和脂肪酸类产品的开发[4-7]。

DHA俗称脑黄金，是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，因其含有6个不饱和烯键的特有结构，使它具有独特的生理功能和经济价值，对人类健康有着特殊的作用和影响[8-9]。

裂壶藻（Schizochytrium limacinum）又称裂殖壶菌，是一类富含DHA的海洋藻类，因其生长速度快、易于培养、细胞内脂肪酸组成简单易于提纯等优势，被认为是一种极具潜力的DHA新来源[10-13]。

美国Martek公司在微生物发酵生产DHA领域进行了深入研究，将裂壶藻发酵生物量提高至200 g/L，DHA产量提升至40 g/L，居世界领先水平。近年来国内高校对裂壶藻发酵产DHA也开展了研究，并取得一定进展，但产量和质量均较国外尚有一定差距，不能够满足巨大的市场需求。

本研究以裂壶藻（Schizochytrium limacinum）ATCC 20888为出发菌株，利用60Co-γ射线对其进行辐照诱变，筛选出最优突变株[14]，用以改善生长培养条件，增加生物量，累积较多的油脂和DHA，用以达到工业生产的目的[15-17]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

裂壶藻（Schizochytrium limacinum）ATCC20888：广东微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

平板与斜面培养基：葡萄糖50 g/L，谷氨酸钠30 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 8 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO46 g/L，金属离子混合液2 mL。

种子培养基：葡萄糖85 g/L，谷氨酸钠60 g/L，酵母膏6 g/L，NaCl 20 g/L，KH2PO46 g/L，MgSO422 g/L，Na2SO40.3 g/L，金属离子混合液2 mL。

发酵培养基：葡萄糖75 g/L，谷氨酸钠15 g/L、酵母膏6g/L、NaCl2.4g/L，KH2PO44.8g/L，MgSO46g/L，KCl0.4g/L，金属离子混合液2.8 mL。

1.1.3 化学试剂

葡萄糖、碳酸氢钠、硫酸钠：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸二氢钾：天津凯通化学试剂有限公司；碱性蛋白酶（20万U/g）、纤维素酶（5万U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司；实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A气相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司；SPX-150C恒温恒湿箱、9070MBE电热鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；YM75立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；RE-52C旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；HYQ-150S全温摇床：武汉汇诚生物科技有限公司；GZX-XB-K-25血球计数板：盐城市荣康玻璃仪器有限公司；60Co-γ辐照源：湖北省农科院辐照中心。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将菌种转接至富集培基上，于26℃条件下恒温静置培养2～3 d。菌种经富集后，在分离平板上划线分离，26℃恒温培养，经多次分离获得裂壶藻单菌落菌株。挑选纯的单菌落作为活化种子转接液体培养基扩大培养。

1.3.2 种子培养

从平板中纯的单菌落处挑取一环，转接于种子培养基中，置于摇床上26℃、180 r/min条件下培养48 h。

1.3.3 发酵培养

将种子液按10%的接种量转接于发酵培养基中，26℃、180 r/min条件下振荡培养4～5 d。

1.3.4 制备待诱变悬浮液

从活化后的裂壶藻种子中挑选出菌落较大、较纯，生长较快的进行镜检，选择细胞较大，特征典型的经种子培养后，转接发酵培养基，培养至对数期。离心去除上清液，用无菌生理盐水制成悬浮液，血球计数板计数，调整细胞浓度在107～109CFU/mL，待诱变处理。

1.3.560Co-γ辐照诱变

取12支灭菌过的试管，每管分别装入上述悬浮液5 mL。每3个为一组，共分为4组，在湖北省农科院辐照中心进行60Co-γ射线辐照，各组剂量分别为0.4 kGy、0.8 kGy、1.2 kGy、1.6 kGy，剩下的原悬浮液作为对照组。菌株致死率计算公式如下：

式中：A为未经诱变平板上的菌落数，CFU；B为经过诱变后平板上的菌落数，CFU。

1.3.6 突变株的筛选

经过诱变处理的悬浮液经适量稀释平板涂布，26℃培养3 d，观察菌落长势、大小并记录菌落数。挑选形态大，表面光滑的单菌落进行初筛，然后对初筛得到的菌株在发酵培养基中复筛，26℃、180 r/min培养5 d，检测其生物量、油脂含量、DHA产量，保存产量较高的菌种。

1.3.7 突变株遗传稳定性测试

将复筛得到的突变株连续传至5代，再对其进行摇瓶发酵培养，测定生物量、含油量和DHA产量并与初代进行比较，观察其遗产稳定性。

1.3.8 生物量的测定

裂壶藻的生物量以收集的菌体细胞干质量计。取一定体积的培养液装入预先称质量的离心管中，5 000 r/min离心20 min，沉淀用蒸馏水清洗3次，置于干燥箱中，60℃条件下烘干至质量恒定，称质量。生物量的计算公式如下：

1.3.9 油脂的提取及DHA含量测定

藻油的提取：将离心洗涤得到的藻泥与水按料液比1∶1（g∶mL）混合，用碱性蛋白酶0.5%和纤维素酶0.025%在60℃条件下酶解6 h，真空冷冻干燥至质量恒定，研磨成藻粉，用乙醚索氏抽提至菌体至无色，旋转蒸发残留溶剂，置于烘箱干燥至两次质量变化＜0.2 mg，计算油脂质量。油脂产量及含油率的计算公式如下：

DHA含量检测：取0.1 g藻油，加1 mL苯-石油醚体积比为1∶1的混合溶剂，再加1 mL 0.4 mol/L的KOH-CH3OH溶液，摇匀，在室温条件下静置8～10 min，然后加蒸馏水使醚层升至瓶颈部，待液层澄清后，经气相色谱分析得到DHA相对含量。DHA产量计算公式如下：

DHA产量（g/L）=油脂产量（g/L）×DHA含量（%）

1.3.10 气相色谱分析条件

色谱柱：Agilent SP-2560（100 m×25 μm，0.2 μm）；升温程序：100℃保持4 min，以3℃/min升温至230℃，保持20 min，载气（N2）流速25 mL/min，压力2.4 kPa，进样量1 μL；分流比15∶1。

2 结果与分析

2.160Co-γ射线辐照对裂壶藻ATCC20888的致死效应

裂壶藻ATCC20888经过不同剂量的辐照处理后，剂量与裂壶藻致死率之间的关系如图1所示。由图1可知，不同剂量对ATCC20888菌株均有致死效应，且致死率与60Co-γ射线辐照剂量在一定范围内成正相关，剂量越大，菌株致死率越高。当辐照剂量为0.8kGy时，致死率为98.76%，辐射剂量为1.6 kGy时，致死率为99.985%。

2.2 初筛

挑取4个辐照处理组中直径较大的菌落，每组选20个，共80个单菌落，每个菌落划2个平板，共160个平板。置于恒温恒湿培养箱培养3 d。

在以上160个平板中挑选生长快速、无污染、单菌落多且直径大的平板，在其中挑选出40个单菌落平板划线，分别命名为0.4-1～0.4-10、0.8-1～0.8-10、1.2-1～1.2-10、1.6-1～1.6-10置于恒温恒湿培养箱培养3 d。通过比较菌落大小，形状、颜色、透明度、镜检细胞大小、污染度、生物学特征等指标，筛选出24单株。其中包括0.4 kGy 4株，0.8 kGy 6株，1.2 kGy 5株，1.6 kGy 9株。

将以上挑选出的24单株各取一环接入装有5 mL液体培养基的试管中，每株接入3管，共72个试管，置于摇床上，26℃、180 r/min条件下振荡培养7 d后进行涂片、苏丹黑B染色、显微镜镜检。根据污染与否、细胞大小、培养液澄清度、油脂积累量等综合指标筛选出较好的24株，其中包括0.4 kGy处理组4株，0.8 kGy处理组6株，1.2 kGy处理组4株，1.6 kGy处理组10株。准备复筛。

2.3 摇瓶复筛

2.3.1 第一轮复筛

将初筛得到的24株突变菌株和1株出发株分三个批次分别经种子培养后，以10%接种量转接于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，置于摇床上，在26℃、180 r/min条件下振荡培养5 d。放瓶后每株分别取样进行涂片和苏丹黑B染色镜检。每株菌株的发酵液在40～55℃条件下烘干至质量恒定，测定干质量。其结果见表1。

由表1可知，经诱变后的24株突变株与出发株相比，其平均生物量大部分都有小幅度提升。根据24株突变株的生长发育情况、苏丹黑B染色镜检结果及生物量等指标，与出发株相比筛选出较好的7株（0.4-7-2、0.4-9-1、0.8-6-2、1.2-5-1、1.6-1-1、1.6-7-1、1.6-9-3）进行下一轮的筛选。

2.3.2 第二轮复筛

将上轮筛选出的7株突变株与出发菌株经种子培养、摇瓶发酵培养5 d，取样涂片和苏丹黑B染色镜检、以生物量、油脂含量、DHA产量为指标筛选最优突变株。结果（表2）可知，1.6 kGy剂量下有2株突变株其DHA产量超过5 g/L，可以猜想高剂量的辐照强度对正突变有利。经各项指标比较分析，选出3株较优菌株分别为0.8-6-2、1.6-7-1、1.6-9-3。

2.3.3 第三轮复筛

第三轮复筛结果见表3。由表3可知，突变株1.6-7-1其各项指标都优于出发株和其他突变株。经过几轮筛选，选出最优突变株1.6-7-1，其生物量为47.37 g/L，DHA产量为5.65 g/L。

2.4 突变株遗产稳定性实验

经过初筛复筛选出的正突变株1.6-7-1，经过5代连续转接后进行发酵培养，比较每代菌株发酵5 d后生物量、油脂产量、DHA产量，结果见表4。由表4可知，该突变株遗产性能较为稳定，其油脂产量均有大幅度提升，证明了辐照诱变的可行性和科学性。

2.5 脂肪酸组成分析

将1.6-7-1突变株经发酵所产的藻油进行气相色谱分析，结果见表5。由表5可知，裂壶藻脂肪酸组成主要为C16∶0和C22∶6n-3，其中二十二碳六烯酸（DNA）的含量达到了39.92%，表明1.6-7-1突变株经发酵所产的藻油是DNA的良好来源。并且其脂肪酸组成简单，利于提纯。

3 结论

本实验利用60Co-γ射线在1.6 kGy的辐射剂量下诱变，最终筛选得到了一株命名为1.6-7-1的高产DHA的裂壶藻突变株，其平均DHA产量为比出发株提高了约40%，其藻油脂肪酸组成简单，利于提纯，具有良好的商业前景，在以后的研究中可采取复合诱变或者基因重组的方法，同时优化培养基成分及培养条件，有望进一步提高DHA产量，缩小商业成本。

[1]何东平，陈涛.微生物油脂学[M].北京：化学工业出版社，2006.

[2]周茂洪，周林，赵肖为，等.1株裂殖壶菌（Schizochytriumsp.）的分离鉴定[J].微生物学通报，2006，33（4）：48-51.

[3]WU S T,YU S T,LIN L P.Effect of culture conditions on docosahexaenoic acid production bySchizochytriumsp.S31[J].Process Biochem, 2005,40(S31):3103-3108.

[4]胡燕红，姜绍通，罗水忠.米根霉产L-乳酸耐温菌株60Co-γ射线诱变选育[J].食品科学，2008，29（12）：22-23.

[5]佘隽，田华，陈涛，等.高产DHA寇氏隐甲藻突变株的筛选[J].食品科学，2013，34（17）：230-235.

[6]马勇.产油酵母的选育及发酵培养条件的研究[D].包头：内蒙古科技大学硕士论文，2011.

[7]王文翔，赵书林，佘隽，等.高产花生四烯酸的高山被孢霉突变株的选育[J].中国粮油学报，2014，29（7）：92-95.

[8]佘隽，任扬，田华，等.60Co-γ射线辐射诱变寇式隐甲藻6号的技术研究[J].中国酿造，2012，31（2）：147-150.

[9]张超，徐洲，魏琴，等.产油脂和γ-亚麻酸被孢霉M11的诱变[J].食品科学，2010，31（23）：322-325.

[10]朱国胜，刘作易，雷邦星，等.被孢霉γ-亚麻酸高产菌株选育[J].菌物学报，2005，24（1）：85-92.

[11]周蓬蓬，余龙江，李为，等.YAG激光照射对高山被孢霉花生四烯酸产量的影响[J].激光生物学报，2002，11（5）：372-376.

[12]李丽娜，汤华成，于长青，等.深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的微波诱变育种[J].食品与生物技术学报，2009，28（1）：117-121.

[13]马瑞雪，何东平，陈涛，等.Co60辐射诱变深黄被孢霉高产多不饱和脂肪酸突变株的选育[J].中国油脂，2004，29（12）：48-50.

[14]沈丹丹，杨芳芳，万凌琳，等.利用UV和EMS诱变选育高产油微藻藻株的研究[J].中国油脂，2013，38（6）：60-64.

[15]许永，臧晓南，徐涤，等.裂殖壶菌诱变筛选的研究[J].中国海洋大学学报：自然科学版，2012，42（12）：54-58.

[16]卢丽娜.高油脂藻株的筛选、诱变及培养[D].烟台：烟台大学硕士论文，2010.

[17]王卫卫，任鹏康，阎明，等.He-Ne激光对γ-亚麻酸产生菌少根根霉的诱变作用[J].光子学报，2002，31（2）：157-161.

LÜ Xiaoyi1,FU Jie1,YIN Jia1,TIAN Hua1,CHEN Tao2,HE Dongping1*
(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virology,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

Schizochytrium limacinumATCC20888 was mutated by60Co-γ ray irradiation.Using flat growth condition,biomass,oil content and docosahexaenoic acid(DHA)yield as comprehensive indexes,a mutant strain 1.6-7-1 with high DHA yield was screened.The biomass of the strain was 47.37 g/L,oil content was 31.41%,and DHA yield was 5.65 g/L,which was increased by about 40%than the original strain.After five consecutive generationsoffermentation,itsgenetic stabilitykeptwell.

60Co-γ ray;Schizochytrium limacinum;docosahexaenoic acid

Q933

A

0254-5071（2015）04-0106-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.024

2015-03-24

国家粮食局粮食公益性行业科研专项（201313012-03）

吕小义（1991-），男，硕士研究生，研究方向为微生物油脂。

*通讯作者：何东平（1957-），男，教授，博士，研究方向为粮食、油脂及植物蛋白。