山茱萸中有益菌的分离和鉴定

唐艳敏，孙思佳，翟政涛，纪飞

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

山茱萸中有益菌的分离和鉴定

唐艳敏，孙思佳，翟政涛，纪飞

（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）

将药用植物山茱萸作为有益菌的分离源，以获得常见有害菌的抗性菌，提高山茱萸的利用价值。以马铃薯葡萄糖琼脂和营养琼脂平板分离、纯化其体外真菌和细菌，对获得的菌株进行黑曲霉、黄曲霉和大肠杆菌等有害菌的对峙实验，并对抗性菌进行分子生物学和生理生化的种属鉴定。实验结果表明：从山茱萸中分离纯化28株菌（12株细菌、16株真菌），其中2株菌对黑曲霉、黄曲霉有一定的抑菌效果，经分子生物学和生理生化实验鉴定，菌株S136是肠杆菌属（Enterobactersp.）、菌株S138是芽孢杆菌属（Bacillussp.）的细菌。

山茱萸；有益菌；分离鉴定；抗黑曲霉；抗黄曲霉

有益菌即对人体健康有益或是对人类生命活动有益的微生物[1]。筛选有益菌的原则是在自然对抗状态下，寻找能为人类不同生命活动所用的菌株[2]；自1993年STIERLE A[3]等从短叶植物红豆杉内分离出了一株能产紫杉醇的菌株后，植物成了除去土壤和水体外，人们寻找有益菌的另一来源；有益菌具有抗菌[4]、抗虫[5]、防腐[6]等作用，因此对于这类微生物的筛选具有很高的应用价值。

山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）是一种落叶灌木，在河南、甘肃、浙江、湖南等省均有分布，其果实别称山萸肉，是一种药用价值极高的植物，具有补血固精、补益肝肾、调气、补虚、明目等功效[7]，被作为六味地黄丸的主要原料药使用[8]，对其体内外微生物资源的挖掘是充分利用微生物自然资源、提高药用植物利用（应用）价值的一种较好的方法[9]。本试验将山茱萸作为有益菌的微生物筛选来源，对获得的有益菌进行种属鉴定，以提高山茱萸的利用价值，获得有益菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

山茱萸：河南省西峡县山茱萸种植基地。采集后放保鲜袋带回以保持新鲜，当天进行试验，未用完材料用保鲜膜包裹并置于4℃冰箱，延长保存时间。

大肠杆菌（Escherichia coil）CVCC8099：购自中国兽医药监察所；黑曲霉（Aspergillus niger）、黄曲霉（Aspergillus flavus）：由河南工业大学生物工程学院保藏；所用试剂均为国产分析纯。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基：土豆200 g，琼脂20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。

1.2 仪器与设备

SPX-150BS-Ⅱ生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；DHP-9162恒温培养箱、TH2-C恒温摇床：太仓市科教器材厂；VITZK-z全自动微生物分析仪：波舜宇仪器有限责任公司；3730XL测序仪、2720 thermal cycler PCR仪：Applied Biosystems；DYCP-31DN DNA电泳槽、DYY-5稳压电泳仪：北京六一仪器厂；DK-8D电热恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司；FRP980凝胶成像仪：上海复日科技仪器有限公司；HC-2518R冷冻高速离心机：赛齐（上海）生物工程有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 山茱萸中菌种的分离与纯化

取新鲜山茱萸的枝、茎、叶和果实，流水冲洗尘土后，置超净工作台内，用无菌水冲洗，将枝、茎截成1～2 cm长，叶、果半径为0.5～1.0cm，分为A、B组：将A组材料移至营养琼脂培养基上，空白对照加无菌水，于37℃恒温培养1～2d；将B组材料移至PDA培养基上，空白对照加无菌水，于28℃恒温培养4～6 d。对生长的菌株按菌落形态进行分离、纯化、保种。

1.3.2 山茱萸有益菌的筛选

抗大肠杆菌（Escherichia coli）菌株的分离：采用平板对峙法，将菌体浓度为4×107CFU/mL的大肠杆菌液均匀涂布到培养基上，然后在平板上接种纯化的分离菌，37℃培养3～4 d，逐日观察2种菌的生长状况和对峙抑制效果，拍照记录。

抗黑曲霉（Aspergillusniger）、黄曲霉（Aspergillusflavus）菌株的分离：在PDA培养基中央分别接种黑曲霉、黄曲霉为对照，实验组除在中央接种黄曲霉、黄曲霉外，还在距中央20～25 mm处用直径为5 mm的打孔器打4个孔，构成正方形，取培养3 d的菌悬液注入孔中，28℃培养3～4 d，逐日观察对照和实验平板真菌生长状况，以对照组菌落直径与实验组菌落直径差作为抑菌性大小，拍照记录。

1.3.3 山茱萸有益菌的分子生物学鉴定

将有抗性的菌株送上海生工生物公司进行分子生物学种属鉴定。细菌基因组DNA提取按SK8255试剂盒的操作手册进行。16S rDNA测序采用通用引物，上引物为7F（5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），下引物为1540R（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；真菌基因组DNA采用SK8259试剂盒提取，18S rDNA测序采用通用引物，上引物为NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′），下引物为NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）。

25μL扩增体系：2.5μL的10×buffer（含MgCl2），各0.5μL的10 μmol/L的上下引物，1 μL的2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyibonucle oside triphosphate，dNTP），0.2 μL的TaqDNA聚合酶，0.5 μL的20～50 ng/μL基因组DNA模板量，加无菌水至25μL。扩增条件为：94 ℃预变性4min，94℃变性45 s，55℃褪火45 s，72℃延伸1 min，30个循环后最终72℃保持10 min。获得的16S rDNA序列在核糖体数据库http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对，18S rDNA的序列在NCBI上采用Blast软件进行比对，以进化树同源性比例显示种属类型。

1.3.4 山茱萸抗性菌的生理生化鉴定

将获得的有益菌株用VITZK-z全自动微生物分析仪进行生理生化测定，以了解菌株的生物学特性。

2 结果与分析

2.1 山茱萸中菌种的分离与纯化

自山茱萸中共分离菌株28株（12株细菌，16株真菌）。其中，茎中获得14株、枝中获得8株、叶中获得4株、果实中获得2株。菌株分布情况表现为自植株形态学的下端向形态学的上端呈现逐步减少的趋势。

2.2 有益菌的抑菌性

通过抗大肠杆菌、抗黑曲霉、抗黄曲霉的对峙实验，自纯化的山茱萸中获得2株抗性菌，分别编号为S138、S136，其抑菌圈直径和抑菌效果分别见表1。

经过纯化的有益菌S138和S136见图1。由图1可知，S138菌落呈白色，大、不规则，边缘呈锯齿状，菌落扁平、表面干涩，边缘呈褶皱样。S136菌落呈淡黄色、半透明，菌落直径约0.5～1.0 cm，表面隆起、湿润、光滑，边缘整齐。

2.3 山茱萸抗性菌的分子生物学鉴定

对菌株S136和S138进行16S rDNA的PCR扩增，结果见图2。

由图2可以看出，扩增的S136、S138菌株16S rDNA序列条带明亮，无明显的拖带现象，证明分离的序列大小稳定，大致在1 500 bp左右，经测序获得S138和S136的rDNA序列分别为1 472 bp、1 499 bp，结果见图3和图4，在NCBI数据库中进行比对，获得该菌株的种属分类。

S138的rDNA片段大小为1 472 bp，测序结果见图3。S136的rDNA片段大小为1 499 bp，测序结果见图4。

由图3可知，经比对，S138与细菌界、厚壁菌门、芽孢杆菌纲、杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属的细菌同源性为100%。

由图4可知，经比对，S136与细菌界、变形菌门、变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、肠杆菌属的细菌同源性约为98%。

2.4 山茱萸抗性菌生理生化结果分析

将2株有益菌经VITZK-z全自动微生物分析仪的检测，S138菌株采用BCL卡（革兰氏阳性细菌鉴定卡），S136菌株采用GN卡检测2株有益菌的生理生化反应特性，结果分别见表2、表3。

根据2株有益菌的生理生化特性，与分析仪内贮藏信息比对，鉴定结果同分子生物学鉴定一致，上述大量的生理生化分析数据为S138、S136菌株的应用提供了完整的信息。

2.5 讨论

本试验共获得2株对黑曲霉、黄曲霉有明显抗性的细菌。这对于生物防治真菌、特别是生物方法防治粮食中霉变菌的污染具有重要的意义[10]。有益菌不仅能减少化学防腐剂的毒性，而且长期使用也不会对生态环境造成一定的威胁，还对人类的健康有益[11-12]。从安全、健康、环保的多角度来说，对于抵抗黑曲霉、黄曲霉等常见霉变菌菌株的开发研究可以为食品防腐、粮食防霉提供新的思路、寻求新的方法[13]。

目前菌物的许多序列系统发育研究都集中在核编码的核糖体基因上，包括较大的重复数量、不平常的碱基比率，以及DNA引物较早的出现，rDNA基因不同区域的进化速率显著不同，使得其能够在确定菌株分类地位中得到应用[14]。各种精密仪器高通量的检测也对实验起到了很大的帮助，全自动微生物分析仪能够在24 h内得到47个生理生化反应特性的结果，大大提高了试验的效率，为试验的下一步研究节省了大量时间。

理想有益菌的各种特性很难集中于自然微生物体中，因此，除了在筛选途径上进行深入探索外[15]，有益菌的定向遗传改造及其活性代谢产物的研究也是未来的方向。

3 结论

以山茱萸为有益菌的来源，自山茱萸中分离28株菌，其中S138、S136对黑曲霉、黄曲霉有明显抑菌效果，经分子生物学鉴定与生理生化鉴定，确定S136是肠杆菌属、菌株S138是芽孢杆菌属的细菌。实验证实，山茱萸体外存在有应用价值的抗性菌株，可作为抗性菌的分离资源。

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TANG Yanmin,SUN Sijia,ZHAI Zhengtao,JI Fei
(College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China)

The aim of this research is to obtain the beneficial microbes fromCornus officinalis,the traditional medical plant in China,and then raise the application value ofC.officinalis.The fungi and bacteria fromC.officinaliswere isolated and purified by potato dextrose agar and nutrition agar, respectively.Then antagonist tests were performed between the obtained microbes and harmful microbes,such asAspergillus niger,Aspergillus flavus,andEscherichia coli.The beneficial microbes were identified by molecular biological identification and physiological and biochemical identification.The results showed that 12 bacterial strains and 16 fungal strains were isolated fromC.officinalis,in which 2 bacterial strains showed certain bacteriostatic effect onA.nigerandA.flavus.After the identification,results showed that strain S136 wasEnterobactersp.,and strain S138 was Bacillussp.

Cornus officinalis;beneficial microbe;isolation and identification;anti-Aspergillus niger;anti-Aspergillus flavus

Q939.9

A

0254-5071（2015）04-0097-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.022

2015-03-09

大学生挑战杯比赛项目

唐艳敏（1990-），女，本科生，研究方向为药用植物的有益菌。