抑制烟草黑胫病的混合菌株优化

施渺筱，郭博恺，万科，丛铭，张传萍，李祝*

（1.贵州省安顺学院农学院，贵州安顺561000；2.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳550025）

抑制烟草黑胫病的混合菌株优化

施渺筱1，郭博恺2，万科2，丛铭2，张传萍2，李祝2*

（1.贵州省安顺学院农学院，贵州安顺561000；2.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳550025）

通过正交试验筛选混合菌株有效抑制烟草黑胫病病原菌（Phytophthora parasitica）菌丝的生长，其中1107、1205、1601、5801和7403五株芽孢杆菌（Bacillus）在室内NYBD培养基上培养，参照5因素3水平正交试验设计进行混菌比例优化。结果表明，1107菌株在生物量和抑菌活性方面都表现出了显著性。5株芽孢杆菌（1×108CFU/mL）的最优组合为芽孢菌株1107、7403、1601、5801的添加量均为1.2 mL，芽孢菌株1205添加量为0.6 mL。在此优化条件下，生物量（OD600nm值）为3.18±0.02，抑菌圈直径为（24.22±0.68）mm，分别比单独培养的菌株或其他混合菌株都显著提高。

烟草黑胫病原菌；生物量；正交试验；抑菌活性

烟草黑胫病[Phytophthoraparasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）Tuker]是引起烟草黑胫病的唯一病原菌，在自然条件下寄主范围广泛[1-2]，严重危害作物的生长。烟草黑胫病是烟草生产中危害最严重的土传病害之一，在我国云贵川三大烟区均有不同程度发生，而且每年的经济损失高达亿元，仅次于烟草病毒病[3]。由于该病菌的游动孢子形成快且数量大，侵染烟株后潜育期短、发病快，在一个生长季节可以发生多次再侵染，同时该病有时还与其他病害混合发生，从而导致一些抗黑胫病品种抗性的丧失[4]。前人已对烟草黑胫病发生的预测、抗病品种的选育、轮作、化学防治等方面进行了大量研究，取得了一定成效[5-8]。生产上用来防治烟草黑胫病的化学药剂以甲霜灵和乙磷铝为主[9]。根据有关报道，在大田中大面积且长期重复性地大量使用同一种杀菌剂或作用机制相同的几种内吸性杀菌剂，极其容易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降[4]。生物防治安全、无污染、无公害，是对烟草上有害生物进行综合治理的发展方向[10]，从现有烟草黑胫病生物防治的研究报道来看，采用的微生物种类有细菌、真菌、病毒等，其中细菌种类较多[11]，特别是芽孢杆菌因其具有较强的抗逆性、容易保存显示出巨大的生防潜力和前景。本实验选取筛选出来的5株芽孢杆菌（Bacillus）菌株进行混菌培养试验，研究其对烟草黑胫病菌病原菌的拮抗作用，对植物病害生防有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌株

烟草黑胫病菌病原菌烟草疫霉（Phytophthora parasitica）：贵州大学生命科学院真菌资源研究所提供。

拮抗细菌：芽孢杆菌（Bacillus）菌株5株，即1107、7403、1205、1601、5801。

1.1.2 培养基

营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.2。

营养肉汤（nutrient broth，NB）培养基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，pH 7.2±0.2。

LB（Luria-Bertani）培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化钠10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.4。

酵母蛋白胨（yeast saccharose peptone，YSP）培养基：酵母浸粉5.0 g，蔗糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：用于拮抗菌培养滤液制备。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，将去皮马铃薯切块，加1 000 mL水煮沸30 min，用双层纱布过滤，取滤液加葡萄糖，加水补足1 000 mL，pH自然。121℃灭菌30 min。

普通酵母牛肉蒸馏水培养基（normal yeast beaf distilled water，NYBD）培养基：牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 主要试剂

葡萄糖（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；琼脂粉：上海博微生物科技有限公司；牛肉膏：北京双旋微生物培养基制品厂；蛋白胨、酵母膏：北京奥博星生物技术有限公司；氯化钠：天津市协和昊鹏色谱科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ECLIPSE-E100生物显微镜：日本Nikon公司；PHSJ-4A精密酸度计：上海大普仪器有限公司；SW-CJ-1FD净化工作台：苏州净化设备有限公司；BS110S电子天平：北京赛多利天平有限公司；KW-1000DC电热恒温水槽：江苏金坛市中大仪器厂；SHP-250电热恒温培养箱：上海光都仪器设备有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；759分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基础发酵培养基的筛选

分别制作NA、NB、LB、PDA、NYBD和YSP供试发酵基础培养液各30 mL分装于100 mL三角瓶中，121℃灭菌20 min。在上述培养基中分别接种等量28℃、160 r/min振荡过夜得到的拮抗细菌种子液1×108CFU/mL，28℃、160 r/min振荡48 h，以不接种拮抗细菌种子液的培养液为对照，分光光度计测定波长600 nm处的吸光度值。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制生长曲线。于4 000 r/min条件下离心10～15 min，弃上清液。沉淀用蒸馏水洗1～2次，然后烘干至质量恒定。

1.3.2 拮抗菌株混菌比例优化正交试验

对1107、7403、1601、5801、1205五个菌株进行相互间拮抗试验，检测菌株无拮抗性，以NYBD液体培养基为发酵培养基，正交设计因素与水平见表1，对5个拮抗细菌的3个水平接种量进行混菌发酵，筛选拮抗效果较好的组合可进行大田试验[12]。拮抗实验利用陈志谊等[18]的方法，各个菌株在NA斜面上生长48 h后，各自移植到50 mL培养液中，28℃振荡培养（150 r/min）36 h，拮抗菌液含菌量为1010CFU/mL，取l mL菌液加入100 mL无菌水中，振荡摇匀，稀释至108CFU/mL，取5 mL稀释菌液均匀涂布在NA平板上（被测菌株）；把灭菌的直径为5 mm滤纸片浸入另一菌株含菌量为108CFU/mL的菌液中（测试菌株），浸泡10 s，放置到带菌的平板（被测试菌株）上，在25℃条件下培养48 h，测量各菌株拮抗圈的大小（所有菌株均用作被测试菌株和测试菌株），交叉测试每个处理重复3次，整个试验进行2次。

1.3.3 统计分析

所有实验分别进行3次重复，所有数据通过K-S检验（SPSS17.0）。

2 结果与分析

2.1 基础发酵培养基的筛选

基础发酵培养基的筛选结果见图1。由图1可知，菌株1107在YSP中的生长最好，经SPSS17.0分析，OD600nm值显著大于其他NA、NB、LB和PDA 4种培养基；菌株7403、1205、1601和5801均在NYBD中生长最好，都显著高于其他5种培养基。因此，选择NYBD作为后续培养基。

2.2 拮抗菌株混菌比例优化正交试验

对5个拮抗菌株进行两两拮抗性测试，表明它们相互之间没有拮抗性。以NYBD作为发酵培养基，根据L27（35）正交试验设计，结果与分析见表2，方差分析见表3。

由表2可知，对发酵生物量的影响大小依次为芽孢菌株1107（A）＞芽孢菌株1601（C）＞芽孢菌株1205（E）＞芽孢菌株7403（B）＞芽孢菌株5801（D）。以发酵生物量为评价指标，各因素的最佳组合为A2B3C3D3E2，即芽孢菌株1107（A）0.6 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2 mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）0.6mL。对抑菌活性的影响大小依次为芽孢菌株1107（A）＞芽孢菌株5801（D）＞芽孢菌株1601（C）＞芽孢菌株1205（E）＞芽孢菌株7403（B）。以抗菌活性为评价指标，各因素的最佳组合为A2B3C3D3E3，即芽孢菌株1107（A）0.6 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2 mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）1.2 mL。分别对以上两个组合进行了验证试验，确定了5株芽孢杆菌的最优组合为A3B3C3D3E2，即以NYBD作为发酵培养基，分别将芽孢菌株1107、7403、1601、5801（1×108CFU/mL）以1.2 mL的添加量和芽孢菌株1205（1×108CFU/mL）以0.6 mL的添加量加到40 mL发酵培养基中，28℃、160 r/min振荡48 h，生物量OD600nm为3.18±0.02，抑菌圈直径为（24.22±0.68）mm，分别比单独培养的菌株或其他混合菌株都显著提高。

由表3、表4可知，各因素对生物量、抑菌圈的影响均不显著。

3 结论

筛选生防菌、生防病毒、生防制剂以及植物性提取物是防治烟草黑胫病的一种安全、有效途径[9]。丛铭等[17]分离到的蜡样芽孢杆菌抑制黑胫病效果达到（20.5±0.19）mm（含滤纸片），而本研究通过正交试验得到了拮抗效果最优组合A3B3C3D3E2，即在细菌液浓度均为1×108CFU/mL条件下，芽孢菌株1107（A）1.2 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）0.6mL。在此条件下，生物量（OD600nm）为3.18±0.02，抑菌圈直径达到了（24.22±0.68）mm，效果更佳。

生防菌对烟草黑胫病菌的拮抗能力并不等同于防治能力，防治效果往往与制剂的剂型、生防菌剂的田间适应能力、菌株的繁殖能力等密切相关[13]。芽孢杆菌作为目前广泛使用的生防菌其具有抗菌物质活性高、易于进行分子加工等特点[14]，所以对于单一剂型和混合剂型的田间效果会在下一步的大田应用研究中继续跟进。

近年来，用芽孢杆菌进行土传病害防治的例子很多，一些芽孢杆菌在防病的同时也存在促生的作用，能明显增加作物的产量[15]。除此之外，芽孢杆菌产生的芽孢对化学应激和物理应激均有较强的抵抗能力，有利于它们在土壤环境中生长增殖，适用于植物土传病害的生物防治[16]。本研究表明混合菌种能够比单一菌种显著提高病害防治效果，其机理是混菌搭配产生的防治效果更广，同时，混菌对黑胫病共同作用时，产生的抑菌活性物质可能与各菌株之间的协同作用有很大关系，菌株之间的相互作用可能对促进拮抗物质的产生比靠单一菌株的产生效果更好，该结果为推动环境友好型农业生产提供了佐证，也为大田应用中使用单一菌株进行病害防治提供补充，但其机理需进一步研究。

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SHI Miaoxiao1,GUO Bokai2,WAN Ke2,CONG Ming2,ZHANG Chuanping2,LI Zhu2*
(1.College of Agriculture,Anshun University,Anshun 561000,China; 2.Institute of Fungus Resources,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Mixed strains which suppress the growth ofPhytophthora parasiticavar.nicotianae mycelial were screened by orthogonal experiment. Bacillusstrains 1107,1205,1601,5801 and 7403 were cultured in NYBD medium,and the optimal mixed strain proportion was optimized by 5 factors3 levelsorthogonalexperiment.Resultsindicated thatbiomassand bacteriostatic activityofstrain 1107 were significant.The results showed that the optimum mixed strains(1×108CFU/mL)addition wereBacillus1107 1.2 ml,Bacillus7403 1.2 ml,Bacillus1601 1.2 ml,Bacillus5801 1.2 ml,Bacillus1205 0.6 ml.Under this condition,the OD600nmwas 3.18±0.02 and the inhibition zone diameter reached(24.22±0.68)mm,greatly increased than other mixed strains and the single cultured ones.

Phytophthora parasiticavar.nicotianae;biomass;orthogonal experiments;antibacterial activity

Q939.97

A

0254-5071（2015）04-0082-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.018

2014-12-30

毕节市烟草公司项目（2013（03）号）；贵州省科学技术厅、安顺市人民政府、安顺学院联合科技基金资金资助（黔科合J字LKA [2012]06号）

施渺筱（1971-），女，教授，博士，主要从事生物化学及微生物学研究工作。

*通讯作者：李祝（1978-），女，教授，博士，主要从事农业微生物学研究工作。