白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白的分离纯化

田童童，巩子路，朱新荣，张建*，牛玉静，刘娟，李甜

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白的分离纯化

田童童，巩子路，朱新荣，张建*，牛玉静，刘娟，李甜

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

以白斑狗鱼为研究对象，选取鱼皮组织为试验材料，通过单因素及响应面试验对鱼皮抗冻蛋白提取工艺条件进行优化。以抗冻蛋白的热滞活性（THA）作为考察指标，对提取温度、提取液的pH值、提取时间及料液比进行探讨。结果表明，在提取温度8℃、提取液pH值为8.4、提取时间2 h，料液比1∶3.8（g∶mL）的工艺条件下，模型预测的热滞活性为0.072 0℃。经验证试验，发现其热滞活性为（0.069 0±0.002 4）℃，试验值与预测值差异较小，表明模型具有一定可靠性。通过柱层析对白斑狗鱼鱼皮抗冻蛋白进行分离纯化，纯化后的抗冻蛋白达到电泳级，且其分子质量约为6 400 u，热滞活性大约为（0.050 2±0.002 2）℃。

白斑狗鱼鱼皮；抗冻蛋白；分离；纯化

生存于极端寒冷环境中的硬骨鱼类，都可以合成某种抗冻蛋白、抗冻多肽或者是抗冻糖蛋白，以此来保护自身免受寒冷的迫害[1-2]。抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又称热滞蛋白，具有防止生物有机体遭受冻害的特殊功能。根据抗冻蛋白不同的理化性质及结构特征将其分为4种类型，分别为AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ和AFPⅣ。然而，尽管蛋白质结构各不相同，但是所有的抗冻蛋白都可以通过与冰晶表面特异性的结合非依数性的降低溶液的冰点，从而抑制冰晶的进一步生长以达到保护体细胞的目的[3]。

起初，研究学者认为抗冻蛋白的合成仅仅局限于肝脏器官（肝型抗冻蛋白）。肝脏分泌的抗冻蛋白进入血液，通过血液流动将抗冻蛋白带入体细胞的周围，从而起到保护体细胞免受冻害的作用。然而，最近的研究表明，冬季比目鱼和杜父鱼的上皮细胞组织中具有合成抗冻蛋白（皮肤型抗冻蛋白）的功能，尽管其具有同样的热滞活性（thermal hysteresis activity，THA），但是这类抗冻蛋白在理化性质及结构特征上都不同于肝型抗冻蛋白[4-5]。

此外，通过上皮组织分泌的抗冻蛋白缺乏信号传导功能且与肝型抗冻蛋白的基因序列大不相同，但他们直接存在于体细胞内，因此同样可以发挥其耐受寒冷环境的作用。据文献报道，皮肤型抗冻蛋白已经被公认为一种新型的抗冻蛋白，栖息于寒冷的海洋环境中的鱼类都具有普遍的抗冻特征[6]。更有学者认为，肝型抗冻蛋白是从皮肤型蛋白进化而来[7-8]。

抗冻蛋白因其具有热滞活性，在冷冻食品加工与储藏、抗冻作物栽培、渔业养殖、医学上器官移植和冷冻手术以及工业上高级防冻剂开发中具有诱人的应用前景。尽管科学家们已经发现了数十种抗冻蛋白，然而他们仍然不断从新的资源中寻找冻活性更强的抗冻蛋白，为开发高产量、高活性和低成本的抗冻蛋白提供更有价值的理论依据，新疆由于特殊的地理环境而使得生物具有特殊的生理特征，为研究者们寻找新的抗冻蛋白提供了良好的资源。

本试验以生存于新疆北部额尔齐斯河流域的白斑狗鱼为研究对象，以鱼皮作为试验原材料，通过传统的分离方法，在单因素试验的基础上应用响应面分析法优化提取抗冻蛋白的工艺参数，并且通过阴离子交换柱层析及凝胶柱层析对抗冻蛋白进行纯化，以期为今后抗冻蛋白的开发与应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白斑狗鱼：购买于石河子市农贸市场；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、考马斯亮蓝R-250、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylene-diamine，TEMED）：美国Sigma公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-50、弱阴离子（DEAE）高流速琼脂糖凝胶：美国GE-Healthcare Bio-Sciences AB公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密酸度计、Heraeus Multifuge X3R台式高速冷冻离心机：美瑞泰克科技有限公司；FA1004型电子天平：上海精科电子天平厂；Mini-protein III型电泳仪：美国Bio-Rad公司；FDU-1200真空冷冻干燥机：日本Rikakikai公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将白斑狗鱼麻醉，将其上皮组织从鱼体剥离，用液氮冷冻后立即粉碎，于-70℃的超低温冰箱中保存备用。称取一定量的样品与等体积的Tris-HCl（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，20 mmol/L VC）缓冲溶液充分混合，于4℃冷藏箱中静置过夜。然后于5 000 r/min，4℃的条件下离心分离10 min，取上清液进行冷冻干燥，即为抗冻粗蛋白[9]。

1.3.2 单因素试验

以Tris-HCl缓冲液为提取液，分别探讨不同提取温度（-4 ℃、0 ℃、4 ℃、8 ℃、12℃）、料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5（g∶mL））、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和提取时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）对抗冻蛋白提取的影响。

热滞活性（THA）参考VALERIO R P等[10]报道的方法进行测定。

1.3.3 响应面试验

为了得到鱼皮抗冻蛋白提取的最优工艺参数，在单因素试验的基础上，以热滞活性（THA）（Y）为响应值，利用响应面分析法（response surface methodology，RSM）对鱼皮抗冻蛋白的提取进一步的优化，因素与水平编码如表1所示。

1.3.4 鱼皮抗冻蛋白的纯化

将抗冻粗蛋白溶解于pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液中，通过0.45μm的针孔滤膜过滤后过夜透析，期间更换透析液3～4次，超滤浓缩后上样于阴离子柱，用4倍体积Tris-HCl（pH 8.0）洗脱，再用600 mL含0～0.8 mol/L NaCl的Tris-HCl进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，每5 min收集一管，分管收集。将具有活性的蛋白液浓缩至5 mL，以待下一步的凝胶层析[11]。凝胶层析参考DENG G J等[12]报道的方法。

1.3.5 SDS-PAGE电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）参照CHALKLEYRJ等[13]报道的方法进行试验。

2 结果与分析

2.1 单因素结果分析

2.1.1 料液比对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响

以pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液为提取液，提取温度设定为4℃，提取时间为1.5 h。探讨不同料液比对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图1所示。

由图1可知，随着料液比的不断增加，抗冻蛋白的热滞活性呈现出先上升后下降的趋势。当料液比达到1∶3（g∶mL）时，鱼皮抗冻蛋白的热滞活性达到最高，其THA为（0.058 0±0.004 2）℃，继续增加料液比的比例，热滞活性逐渐降低。抗冻蛋白的热滞活性之所以会呈现明显下降的趋势，这可能是因为抗冻蛋白的浓度与其热滞活性有关。起初抗冻蛋白的热滞活性随着料液比增加的增加，主要是因为其抗冻蛋白的浓度越来越高，因此热滞活性也越来越大，随着提取液不断增加，在样品中总蛋白量不变的情况下，其抗冻蛋白的浓度则随之降低，因而造成其热滞活性下降。

2.1.2 pH值对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响

以Tris-HCl缓冲液为提取液，提取温度设定为4℃，提取时间为1.5 h，料液比为1∶3（g∶mL），探讨不同pH值的提取液对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图2所示。

由图2可知，抗冻蛋白的热滞活性随着pH值的升高而不断地上升，当提取液的pH值为8.0时，其热滞活性达到最高，为（0.063 0±0.002 1）℃。当提取的pH值＞8.0时，其热滞活性似有下降的趋势。这可能是因为蛋白质的溶解度与提取液的酸碱性有关。在酸性条件下蛋白质的溶解度较低而在碱性条件下溶解度较高而造成的。随着pH值的增加，更多的抗冻蛋白溶出使其浓度升高，因而热滞活性也在不断的增加。然而，当提取液pH值为9.0时，其热滞活性似有下降趋势。虽然碱性环境条件下有益于蛋白质的溶出，但是强碱会破坏抗冻蛋白的空间结构从而影响其功能性质，进而导致其热滞活性降低。

2.1.3 提取时间对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响

以pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液为提取液，提取温度设定为4℃，料液比为1∶3（g∶mL），探讨不同提取时间对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图3所示。

由图3可知，抗冻蛋白的热滞活性随着提取时间的延长而呈现上升的趋势，当提取时间为1.5 h时，其热滞活性达到最高，为（0.067 0±0.001 5）℃。然而当提取时间＞1.5 h时，抗冻蛋白的热滞活性基本保持稳定不变。这主要是因为鱼皮抗冻蛋白在提取液中溶出速率有一定的相关性，在1.5 h之前，鱼皮抗冻蛋白随着提取时间的延长而逐渐溶解于缓冲溶液中，其浓度也随之升高，因而热滞活性逐渐增加。然而，当提取时间＞1.5 h后，鱼皮抗冻蛋白已经基本完全溶解于缓冲溶液中，其浓度达到了最大，故热滞活性在此之后基本保持不变。

2.1.4 不同温度对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响

以pH值为8.0 Tris-HCl缓冲液为提取液，提取时间为1.5 h，料液比为1∶3（g∶mL），探讨不同提取温度对鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响，其结果如图4所示。

由图4可知，抗冻蛋白的热滞活性随着提取温度的升高而逐渐增加，当提取温度为8℃时，热滞活性达到最高，为（0.075 0±0.001 9）℃。温度过高会使本来生存于极端寒冷环境中的白斑狗鱼鱼皮蛋白发生结构变化，使得空间结构排列紧密的蛋白质变得松散，更有益于蛋白质的溶出，如此抗冻蛋白的浓度升高，热滞活性也逐渐增加。继续升高温度则会使蛋白质的固有属性发生质的变化，进而影响了抗冻蛋白的热滞活性。

2.2 响应面分析法结果分析

在单因素试验的基础上，为了得到更优的分离提取抗冻蛋白的工艺参数，利用Design-Expert 8.0软件中的中心组合设计(center composite design，CCD)原理对4个单因素进一步优化。响应面分析试验结果如表2所示，方差分析结果如表3所示。

由表3可知，该响应面模型的P=0.000 2＜0.001，因此试验设计及结果可靠，该模型适用于优化本试验的工艺参数。PX2＜0.000 1，统计学表示差异极显著，故pH值对其影响较大。各因素之间的交互作用对白斑狗鱼鱼皮抗冻蛋白提取的影响也较为显著，如PX2X3=0.006 8＜0.05，说明pH值和提取时间的交互作用较显著，同理PX2X4=PX3X4= 0.038 4＜0.05，表明pH值与料液比、提取时间与料液比之间的交互作用差异性也显著。

各个因素经过回归拟合后的回归方程为：

通过软件求解方程，并根据实际操作条件得出最优工艺条件为提取温度8℃，提取液pH值为8.4，提取时间2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），该条件下鱼皮中抗冻蛋白热滞活性为0.072 0 ℃。

响应曲面图是响应值与各因素之间互相影响构成的三维立体图形及二维等高图，能够较为全面的反映出其中两两因素之间对响应值的关系[14-15]，试验的响应曲面如图5所示。

由图5A可知，对热滞活性影响较为显著的是pH值，而温度影响较小。热滞活性随着pH值升高不断增加，随着提取温度升高则未发生明显变化。由图5B可知，两因素与响应值并未形成明显的曲面图形，热滞活性没有增减趋势。由图5C可知，料液比对鱼皮抗冻蛋白的热滞活性的影响显著，而提取温度则对其没有明显影响。热滞活性随着温度不断升高未呈现出增减趋势，而随着液料比的不断上升则先呈现增后减之趋势，故液料比的影响较大。由图5D可知，pH值与提取时间的交互作用对白斑狗鱼鱼皮抗冻蛋白的热滞活性具有明显的二次效应，响应曲面坡度较陡，说明二者之间的交互作用对其热滞活性的影响极显著。由图5E可知，pH值和液料比对热滞活性都表现出二次效应，表明热滞活性随着缓冲液pH值和液料比的增加而升高，说明二者之间交互作用对热滞活性的影响非常显著。由图5F可知，热滞活性随着提取时间的延长并没有明显的变化，而随着液料比的增加则呈现出先增后减的趋势。

综上所述，提取温度对白斑狗鱼鱼皮抗冻蛋白热滞活性的影响较小，缓冲溶液的pH值对其影响较大。此外，pH值，提取时间与料液比三者之间，两两因素对其热滞活性的差异性影响较为显著。

2.3 鱼皮中抗冻蛋白的分离纯化

由图6可知，经DEAE-Sepharose阴离子交换柱后有一个吸收峰出现，将该峰下的收集液经SDS-PAGE电泳检测后为杂蛋白，如图7A所示。将吸收峰较高的抗冻蛋白样品收集合并，浓缩后过分子筛柱进行纯化。经Sephadex G-50凝胶层析后也有吸收峰出现，经SDS-PAGE电泳检测该峰处的蛋白质达到电泳纯，其分子质量约为6 400 u，如图7B所示，THA大约为（0.050 2±0.002 2）℃。

3 结论

白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白提取的最佳工艺条件为提取温度8℃、pH值为8.4、提取时间2 h，液料比1∶3.8（g∶mL），该条件下模型预测鱼皮中抗冻蛋白的热滞活性为0.072 0℃。为了验证模型的可靠性，进行了验证试验，结果显示白斑狗鱼鱼皮中抗冻蛋白的热滞活性为（0.069 0±0.002 4）℃，与理论预测值基本吻合。利用离子层析及凝胶层析获得了电泳级的鱼皮抗冻蛋白，且只含有一个分子质量约为6400u的亚基。同时，测其THA大约为（0.0502±0.0022）℃。

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TIAN Tongtong,GONG Zilu,ZHU Xinrong,ZHANG Jian*,NIU Yujing,LIU Juan,LI Tian
(College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

WithEsox luciusas the research object andE.luciusskin tissue as experimental material,the antifreeze protein(AFP)was isolated and purified by single factor experiment and response surface methodology.Using thermal hysteresis activity(THA)of AFP as index,four factors of extraction temperature,extraction buffer pH,extraction time and solid-liquid ratio was optimized.Eventually,the results showed that the THA of AFP from skin tissues was up to 0.072 0℃under the condition of extraction temperature 8℃,pH 8.4,extraction time 2 h and solid-liquid ratio 1∶3.8(g∶ml),respectively.Additionally,the verification experiment revealed that the THA was(0.069 0±0.002 4)℃,similar to the experiment value,which indicated that the model was reliable.The AFP separated and purified by column chromatography was electrophoresis level,the molecular weight was 6 400 u,and the THA was about(0.050 2±0.002 2)℃.

Esox luciusskin tissue;antifreeze protein;isolation;purification

Q51

A

0254-5071（2015）04-0072-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.016

2015-01-23

国家自然科学基金（31260366）；石河子大学青年骨干教师培训（3152SPXY01027）

田童童（1990-），男，硕士研究生，研究方向为食品生物化学。

*通讯作者：张建（1979-），男，副教授，博士，研究方向为食品生物化学研究工作。