不同固定化酵母载体对啤酒风味成分影响研究

先元华，朱玉洁，梁宗余

（1.宜宾职业技术学院生物与化工工程系，四川宜宾644003；2.江苏食品药品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安223200）

不同固定化酵母载体对啤酒风味成分影响研究

先元华1，朱玉洁2，梁宗余1

（1.宜宾职业技术学院生物与化工工程系，四川宜宾644003；2.江苏食品药品职业技术学院生物与化学工程学院，江苏淮安223200）

采用气相色谱分析法，主要考察了山毛榉木片、多孔陶瓷和海藻酸钠3种固定化酵母载体对啤酒风味物质成分的影响。结果表明，不同固定化酵母载体对啤酒风味物质成分的形成有较大影响，其中海藻酸钠载体固定化酵母的牢固程度最好，且载体正丙醇、异丁醇和异戊醇含量分别高于成品啤酒9%、8%和12%，啤酒含醇量较高，适于醇厚型啤酒发酵；山毛榉木载体生成的酯类物质较多，载体乙酸异丁酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯含量分别高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，含酯量较高，适于淡爽型啤酒发酵；与另两种载体相比，多孔陶瓷载体双乙酰含量达到0.14 mg/L，不适合用于啤酒发酵。

固定化酵母载体；啤酒；气相色谱；风味物质

风味物质是啤酒发酵过程中产生的副产物，随着发酵工业的不断发展，目前越来越受到人们的关注[1-2]。越来越多的企业意识到稳定优质的啤酒风味质量是市场竞争中取胜的关键。近年来国内外很多学者使用不同载体对啤酒固定化连续发酵进行了研究：杨秋明等[3]以海藻酸钠，程江峰等[4-5]以陶瓷，LINKO M等[6-7]以山毛榉木片，陈功等[8]以聚乙烯醇（PVA）与阴离子交换树脂（苯乙烯型）混合制成的生物膜，BRANYIK T等[9]以玉米芯作为载体，石小霞等[10]以海藻酸钠-聚乙烯醇，分别对固定化载体连续发酵啤酒进行了深入的研究

但以上研究仅局限于单一载体方面的研究且连续化程度不高，在实验过程中难免造成样品对色谱柱污染。随着生物工程技术的发展，应用固定化酵母进行啤酒连续后发酵，将更有利于实行规模效益，促进啤酒生产的现代化、连续化，可以大大缩短啤酒的发酵周期。应用顶空气相色谱法分析啤酒风味物质具有样品基体对色谱柱的污染小、谱图简单、干扰少的优点。

针对目前气相色谱分析啤酒风味物质成分情况，结合啤酒生产工艺特点，采用气相色谱分析不同固定化酵母载体对啤酒风味成分物质的影响，以期对企业实际生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：宜宾食品微生物工程实验室选育保藏；冷却并充氧处理的11°Bx麦汁：宜宾职业技术学院啤酒实训车间制备；山毛榉木（0.8 cm× 0.5 cm×0.12 cm）、多孔陶瓷（1.0 cm×0.8 cm×0.6 cm）：市场购买。

正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯均为色谱纯：天津益仁达化工有限公司；海藻酸钠、氯化钙为分析纯：济南科旭化工有限公司。

1.2 仪器与设备

固定床反应罐（容积为10 L，径高比为1∶4，带有夹套）：自制；GC-6890气相色谱带火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）：美国安捷伦公司；HP-INNOWax毛细管柱（0.53 mm×0.25 μm×30 m）：美国安捷伦公司；HP气相色谱化学工作站、SGH-300高级氢发生器、HP7694E顶空自动进样器：美国安捷伦公司；UV-2401PC紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酵母载体的制备

海藻酸钠载体制备[10]：海藻酸钠质量分数为2%、CaCl2质量分数为3%、酵母液与海藻酸钠包埋比例为1∶6和固定化凝胶珠填充量17.5 g/100 mL。

山毛榉木片和多孔陶瓷载体制备：两种载体分别经沸水蒸煮4 h，取出后浸入体积分数为10%乙醇中2 h，然后取出载体再在沸水中蒸煮1 h。取20 g经上述处理后的湿山毛榉木片（或多孔陶瓷）加入250 mL三角瓶中，向三角瓶中加入浓度为5×106个/mL的酵母液200 mL，用封口膜封口，固定吸附温度为20℃，摇床转速为80 r/min，固定时间为12 h。

1.3.2 发酵方法

取第5天的主发酵液，经3 000 r/min离心10 min后，然后用80℃水浴加热10 min，快速冷却至室温，在自制反应器中温度为10℃条件进行固定化发酵，滞留时间为10 h[11]。

1.3.3 载体固定酵母量的测定

在600 nm波长条件下测定吸光度值[12-13]，通过酵母标准曲线换算出三角瓶液体中的酵母浓度，从而可知载体上酵母数量。

1.3.4 风味物质检测方法

样品预处理：发酵液以5000r/min的速度离心10 min，取5 mL上清液经反复过滤后置于20 mL顶空瓶中，自动进样。

标样配制[14]：以体积分数为20%乙醇作为溶剂，于100mL容量瓶中准确添加异戊醇0.30mL、正丙醇0.08mL、异丁醇0.08 mL、正丁醇5 μL、乙酸乙酯0.08 mL、乙酸异戊酯10 μL、己酸乙酯2 μL、辛酸乙酯2 μL、甲酸乙酯1 μL、乙酸异丁酯0.5 μL。另配1%的二甲基硫溶液10 mL，以体积分数为50%乙醇作基质，加二甲基硫0.1 mL，混匀后准确移取此溶液0.05 mL至上述混标中。

气相色谱条件：柱温起始温度为50℃，以10℃/min程序升温至160℃；进样器温度为100℃；检测器温度为300℃；载气为高纯N2，流速为4 mL/min；H2速度为30mL/min；空气为400 mL/min；采用分流进样，分流比为2∶1。

检测方法：采用气相色谱法进行测定，在啤酒样品顶空瓶中准确加入0.10 mL标样溶液，加密封垫和铝帽压紧，轻摇顶空瓶使之混匀，此为测定校正因子时的样品配制方法，作组分定性时加单一标准液，实样测定时不加标液。将样品瓶置于顶空自动进样器中，进行分析。

2 结果与分析

2.1 酵母标准曲线的绘制

在600 nm波长条件下测定吸光度值，以酵母浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制酵母标准曲线，结果见图1。由图1可知，在酵母浓度为0～2.5×105个/mL的范围内，酵母浓度与吸光度值呈正比例关系，酵母标准曲线的回归方程为y=0.184 6x+0.001，相关系数R2为0.995 7，表明二者线性关系良好。

2.2 载体固定酵母量及牢固程度比较

载体对酵母量的固定和牢固程度直接影响啤酒风味的形成。图2显示了海藻酸钠、多孔陶瓷和山毛榉木3种载体的固定酵母量及牢固程度。

由图2可知，海藻酸钠载体固定酵母量最高，生物载荷量达到1.83×107个/g。随着振荡时间的延长，载体上振荡下来的酵母量逐渐增多，0～1 min期间，海藻酸钠载体振荡下来的酵母量最低，这说明海藻酸钠包埋固定酵母细胞牢固能力优于多孔陶瓷载体和山毛榉木载体的固定能力；在1～4 min时间内，多孔陶瓷载体和山毛榉木载体振荡下来的酵母量基本相同；而4 min时海藻酸钠载体仍固定着较多酵母。因此海藻酸钠载体固定化酵母的量最多，牢固程度最好。

2.3 载体对酯类物质含量的影响

酯类物质的含量影响啤酒的香味，从而影响啤酒生成的类型。图3和表1显示了海藻酸钠、多孔陶瓷载体和山毛榉木3种载体啤酒后发酵过程酯类物质的实验效果。

由图3和表1可知，与主酵液相比，3种载体啤酒后发酵过程中酯类物质均有所下降，说明啤酒后发酵正常。成品啤酒乙酸异丁酯和乙酸乙酯生产量分别为0.005 mg/L和 10.11 mg/L。山毛榉木载体生成的乙酸异丁酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯分别高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，说明山毛榉木载体生成的酯类物质较多，适合于淡爽型啤酒发酵。

2.4 载体对醇类物质含量的影响

醇类是啤酒花香气的重要成分，对啤酒香气质量产生直接影响。图4显示了海藻酸钠、多孔陶瓷载体和山毛榉木3种载体对醇类物质的影响情况。

由图4可知，成品啤酒正丙醇、异丁醇和异戊醇生成量分别为9.45 mg/L、10.34 mg/L和26.31 mg/L。山毛榉木载体和多孔陶瓷载体醇类物质含量均低于成品啤酒。海藻酸钠载体生成的正丙醇、异丁醇和异戊醇分别高于成品啤酒9%、8%和12%，说明海藻酸钠生成的醇类物质较多，适合于醇厚型啤酒发酵。

2.5 载体对乙醛物质含量的影响

啤酒中存在乙醛影响着口味的成熟，啤酒中乙醛的阀值为10 mg/L[15]。乙醛含量超过阀值时，啤酒会给人一种粗糙苦味感觉；乙醛含量过高时，啤酒有一种辛辣、腐烂的青草味或青苹果味。图5显示了海藻酸钠、多孔陶瓷载体和山毛榉木3种载体对乙醛物质的影响情况。

由图5可知，成品啤酒乙醛生成量为6.53 mg/L，海藻酸钠、多孔陶瓷载体和山毛榉木三种载体后发酵过程乙醛的生成量分别为6.54 mg/L、6.53 mg/L、6.56 mg/L，说明载体的性质对啤酒中乙醛的含量没有太大影响。

2.6 载体对双乙酰物质含量的影响

双乙酰的含量决定成品啤酒的品质。图6显示了海藻酸钠、多孔陶瓷载体和山毛榉木3种载体啤酒后发酵生产啤酒中的双乙酰情况。

由图6可知，海藻酸钠、山毛榉木作为载体后发酵生产的啤酒中双乙酰含量与成品啤酒相差不大，为0.12 mg/L左右；以多孔陶瓷作为载体后发酵生产的啤酒中双乙酰含量最高，达到0.14 mg/L。双乙酰含量超标会给啤酒带来不愉快的馊饭味，这可能是由于多孔陶瓷载体上酵母量最低，从而降低了双乙酰的还原效率。因此多孔陶瓷载体不适合用作啤酒发酵。

3 结论

实验结果表明：海藻酸钠固定酵母量最高，生物载荷量达到1.83×107个/g，从而导致啤酒双乙酰含量最低。多孔陶瓷固定酵母量最低，降低了双乙酰的还原效率，导致发酵生产的啤酒中双乙酰含量高达到0.14 mg/L，不适合用作啤酒发酵。与主酵液相比3种载体啤酒后酵过程中酯类物质均有所下降，说明啤酒后发酵正常。山毛榉木载体生成的酯类物质较多，载体乙酸异丁酯、乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯生产量分别高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，含酯量较高，适合于淡爽型啤酒发酵使用。海藻酸钠载体固定化酵母的牢固程度最好，且载体正丙醇、异丁醇和异戊醇生产量分别高于成品啤酒9%、8%和12%，啤酒含醇量较高，适合于醇厚型啤酒发酵。

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XIAN Yuanhua1,ZHU Yujie2,LIANG Zongyu1
（1.Biological and Chemical Engineering Department of Yibin Vocational and Technical College,Yibin 644003,China; 2.biological and Chemical Engineering Institute of Jiangsu Food and Drug of Career Technical College,Huaian,223200,China）

The effect of three kinds of immobilized yeast carriers(beech wood,porous ceramics and sodium alginate)on beer flavor composition was analyzed by gas chromatography.The results showed that different carriers had great impact on the formation of the beer flavor,sodium alginate immobilized yeast was the optimal,and the production of the carrier of n-propyl alcohol,isobutyl alcohol and isoamyl alcohol were 9%,8%and 12% higher than the finished beer.The alcohol content of beer was high,which was suitable for mellow beer fermentation.Beech carrier generated more esters.The carrier of isobutyl acetate,ethyl acetate,isoamyl acetate and ethyl caproate content was 20.1%,14.3%,12.5%and 17.4%higher than the finished beer,respectively.The ester content was high,which was suitable for light beer fermentation.Compared with the other two kinds of carriers, porous ceramic carrier diacetyl content reached 0.14 mg/L,not suitable for beer fermentation.

immobilized yeast carrier;beer;gas chromatography;flavor substances

Q81

A

0254-5071（2015）04-0047-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.011

2015-02-27

四川省自然科学基金（2013NY028）

先元华（1967-），男，副教授，硕士，主要从事环境工程研究工作。