腌渍芥菜二次发酵工艺优化及其挥发性成分分析

巢雨舟，邓放明*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

腌渍芥菜二次发酵工艺优化及其挥发性成分分析

巢雨舟1，2，邓放明1，2*

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

为了改善腌渍芥菜的风味，采用单因素和正交试验优化了腌渍芥菜人工接种二次发酵工艺。结果表明，腌渍芥菜多菌种人工接种二次发酵的优化工艺是：在室温条件下，分别接种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）各4%，发酵时间6 d，产品的综合感官品质最好，为32.5分。利用气质联用（GC-MS）对腌渍芥菜、自然二次发酵和人工接种二次发酵芥菜的挥发性成分进行了分析，腌渍芥菜共检测出89种物质，总含量71.81%，自然二次发酵芥菜共检测出95种物质，总含量69.26%，优化工艺人工接种二次发酵芥菜共检测出93种物质，总含量79.45%，挥发性物质种类在经人工接种二次发酵后略有增加，并且总含量最高。

腌渍芥菜；发酵；正交试验；挥发性成分

芥菜（Brassica juncea）是湖南省华容县等地大面积种植的蔬菜，原来当地的农户收获新鲜菜以后，用腌菜坛或大水缸等腌制2～3个月左右以后而成，成品芥菜色泽金黄、具有诱人的酸香味；现在已发展成工业化大规模的生产，利用水泥窖池高盐腌制保存，经过漂洗盐脱、切分、拌料、包装、杀菌等工艺制成成品，实现了常年加工生产。但是这种生产工艺存在两个问题，一是由于芥菜是自然发酵而成，又要长时间保存，所以不可避免腌制时必须要加入大量的食盐，高盐环境抑制了有害微生物生长，同时也使芥菜发酵不充分，导致芥菜风味不佳。二是漂洗脱盐过程中芥菜风味物质损失比较严重。

目前的研究主要集中在利用人工接种优势乳酸菌对芥菜进行发酵[1-5]，人工接种的乳酸菌能够在芥菜发酵菌体系中占据优势地位，加快发酵的速度，且乳酸发酵是腌菜中最为有利的微生物作用，这种作用可以抑制其他的杂菌生长，从而提高芥菜的品质[6]，但这些研究都是以新鲜芥菜为原料而进行的，目前还没有以工业上腌渍芥菜为原料而进行发酵的相关报道，工业腌渍芥菜处于一种半成熟状态，可以通过后续的发酵来提高品质，本试验采用人工接种乳酸菌来对腌渍芥菜进行第二次发酵，气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其挥发性风味物质的变化，旨在提高工业上腌渍芥菜的品质，为改进芥菜加工方法提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌渍芥菜：湖南国泰食品有限公司；Lact.2短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、Lact.5植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：本课题组选育；MRS液体培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HPX-9272MBE数显电热培养箱、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1D型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；SPX-250BⅢ生化培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；QP2010-Plus型气相色谱质谱联用仪：岛津企业管理（中国）有限公司；Hotplate/Stirrer型磁力搅拌器：上海器仁仪器仪表有限公司；SAAB-57330U手动SPME进样器：上海安谱科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加工工艺流程

腌渍芥菜：

新鲜芥菜→一层菜一层盐铺入池中，总盐用量12%～14%→盖上塑料膜密封，填土压实，腌制3个月→切分→漂洗脱盐、挤压脱水（测得总酸含量0.59%，控制含盐量7.5%，含水量70%～75%）

自然二次发酵芥菜：

腌渍芥菜→装入腌菜坛→密封→常温（24～27℃）发酵7 d

人工接种二次发酵芥菜：

1.3.2 单因素试验

以感官评分为评价指标，分别对植物乳杆菌Lact.5接种量、短乳杆菌Lact.2接种量和发酵时间做单因素试验，以确定各因素的影响效果和适宜范围。

1.3.3 发酵工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，选择如表1所示的3因素3水平进行L9（33）的正交试验，以感官评分为评价指标来优化腌渍芥菜二次发酵工艺。

1.3.4 感官评分方法

由10名专业的食品化验员对样品的色泽、气味、滋味、质地4个方面进行打分，每项计10分，满分40分，评分标准参考表2，统计各评审员各项评分和总分的平均值。

1.3.5 顶空固相微萃取条件

取样品约为2 g置于顶空采样瓶中，将已经老化2 h的萃取纤维头插入瓶中，不接触样品，50℃条件下萃取30 min后缩回纤维头，将纤维头插入气相色谱仪进样口热解吸5 min后取出。

1.3.6 GC-MS联用条件

气相色谱条件：参照文献[7]的基础上略加改动，Rtx-5MS色谱柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），载气He，流速1 mL/min，分流比1∶5.0，进样口温度250℃，升温条件：起始柱箱温度40℃，保持3 min，然后以5℃/min升至90℃，保持5 min，再以10℃/min升至250℃，保持5 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电离电压70 eV，离子源温度220℃，接口温度280℃，扫描范围50～1 000 m/z，溶剂延迟时间4 min。

1.3.7 挥发性成分的分析

样品经GC-MS分析后，对照质谱库NIST 11，并结合相关的文献[8-9]进行分析，对相似度＞70的成分进行人工定性，得到各化合物的名称与分子式；采用峰面积归一化法计算各化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌Lact.5接种量对二次发酵芥菜感官品质的影响

采用1.3.1节人工接种二次发酵芥菜加工工艺，接种植物乳杆菌Lact.5（1%、2%、3%、4%、5%），短乳杆菌Lact.2接种量3%，发酵5 d对二次发酵芥菜感官品质的影响，结果见表3。

由表3可知，随着植物乳杆菌Lact.5接种量的增加，芥菜感官品质与盐渍芥菜感官品质（25.7分）相比较，都有不同程度的提升，其中气味的提升程度最大，而色泽和滋味的提升较次，质地方面几乎没有变化；接种量＞3%的感官总分区别不明显，这可能是因为随着Lact.5接种量的增加，发酵速度加快，发酵结束也加快，芥菜腌制成熟了，所以感官上没有太大的变化，选取2%～4%的接种量为正交试验的水平。

2.2 短乳杆菌Lact.2接种量对二次发酵芥菜感官品质的影响采用1.3.1节人工接种二次发酵芥菜加工工艺，接种短乳杆菌Lact.2（1%、2%、3%、4%、5%），植物乳杆菌Lact.5接种量3%，发酵5 d对二次发酵芥菜感官品质的影响，结果见表4。由表4可知，短乳杆菌Lact.2不同接种量对二次发酵芥菜的感官品质与盐渍芥菜感官品质（25.7分）相比较，都有不同程度的提升，也是气味的提升程度最大，色泽和滋味上的提升较次，质地方面几乎没有变化；短乳杆菌Lact.2接种量＞3%，发酵芥菜的感官总分区别不大，选择2%～4%的短乳杆菌Lact.2接种量为正交试验的水平。

另外从表3、表4的结果还可以看出，人工接种乳酸菌二次发酵对芥菜的感官品质都有提升，气味的提升可能是微生物发酵作用导致酯类等香气物质增加，色泽的提升可能是微生物发酵使得芥菜变酸，各种色素类物质在酸性条件下褪去所致，而滋味的产生可能是微生物发酵作用使得呈味氨基酸与有机酸的成分更为复杂所致；另外，植物乳杆菌Lact.5的发酵效果要优于短乳杆菌Lact.2，有很多文献[10-12]表明在腌菜与泡菜的中后期发酵中，植物乳杆菌是优势菌体。

2.3 发酵时间对二次发酵芥菜感官品质的影响

采用1.3.1节人工接种二次发酵芥菜加工工艺，接种植物乳杆菌Lact.5和短乳杆菌Lact.2各3%，发酵（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）对二次发酵芥菜感官品质的影响，结果见表5。由表5可知，人工接种二次发酵芥菜的感官品质与盐渍芥菜感官品质（25.7分）相比较，都有不同程度的提升，随着发酵时间的延长，芥菜的感官评分是先增加，到了7d以后感官评分变化不大，根据此单因素的结果可以看出5 d、6 d、7 d的发酵效果是最好的，但是考虑到发酵时间的延长提高了生产成本，所以选取发酵时间4～6 d作为正交试验的水平。

2.4 腌渍芥菜人工接种二次发酵工艺优化正交试验结果

在单因素试验基础上，采用1.3.1节人工接种二次发酵芥菜加工工艺，对腌渍芥菜人工接种二次发酵工艺优化，结果与分析见表6，方差分析见表7。

由表6可知，各因素对腌制芥菜感官评分影响的主次顺序为植物乳杆菌接种量＞短乳杆菌接种量＞发酵时间，多菌种人工接种二次发酵芥菜工艺的最优条件为A3B3C3，即植物乳杆菌接种量为4%，短乳杆菌接种量为4%，发酵时间为6 d。在此最佳发酵工艺下，腌制芥菜感官评分为32.5分。

由表7可知，因素A、因素B的P值＜0.05，因素C的P值＞0.05，表明植物乳杆菌和短乳杆菌添加量对结果的影响程度差异显著，发酵时间对结果影响程度差异不显著。

2.5 发酵芥菜挥发性成分分析结果

腌渍芥菜、自然二次发酵和人工接种二次发酵芥菜的挥发性成分GC-MS分析的总离子流色谱图见图1，各成分的鉴定结果见表8。

由表8可知，烷烃类、烯烃类、炔烃、芳香烃和杂环类物质都不是蔬菜中的主要风味物质[13]，且相对含量较低。样品1共检出挥发成分89种，总含量71.81%，其中醛类12种（7.78%），酮类7种（3.21%），醇类7种（3.65%），酸类8种（5.82%），醚类3种（10.70%），酚类1种（0.28%），含氮类4种（2.38%），酯类物质29种（30.96%），硫醇1种（0.11%）；样品2共检出挥发成分95种，总含量69.26%，其中醛类14种（7.39%），酮类11种（4.83%），醇类9种（11.06%），酸类6种（2.08%），醚类3种（4.18%），酚类2种（0.31%），含氮类3种（1..67%），酯类物质30种（31.47%）；样品3共检出挥发成分93种，总含量79.45%，其中醛类11种（7.10%），酮类6种（3.40%），醇类12种（13.54%），酸类6种（1.96%），醚类2种（5.02%），酚类1种（0.26%），含氮类3种（1.84%），酯类物质27种（38.11%）。

从各类化合物对比来看，醛类物质中，3个样品的种类和含量区别不大，样品1与样品2共有成分有9个，样品1与样品3共有成分有7个，样品2与样品3共有成分有9个，其中糠醛的含量较高。酮类物质中，样品2的种类和含量最多，其余2个都差不多，3,4,4a,5,6,7-六氢-1,1,4a-三甲基-2（H）-萘酮的含量很高，它是茶香螺烷的一种同分异构体。醇类物质中，样品1的种类和含量最少，样品2和样品3相对较多，这可能是后续的发酵中，微生物代谢所生产的。酸类物质中，样品2、3的区别不大，样品1中较多，其中庚酸的含量有2.69%比其他的挥发酸类含量高很多，只存在于样品1中。醚类物质中，二甲基二硫醚、二甲基三硫醚的含量都很高，含硫类的物质是酸菜中重要的风味物质[14]。酚类物质和含氮物质的差别在3个样品中都不明显，3个样品中苯代丙腈的含量比较高，这也是酸菜中的重要风味物质。酯类物质中，3个样品的含量和种类都是酸菜中最多的，都在总物质含量的30%以上，这也证明了酯类物质是腌渍芥菜中最重要的挥发性物质，其中异硫氰酸丙烯酯的含量最高，异硫氰酸酯类物质一般都具有强烈的催泪性刺激辛香味，它是十字花科类植物中的辛辣风味物质[15]，在酯类物质这一最重要物质的含量上人工接种二次发酵芥菜达到了38.11%，很大程度上高于自然二次发酵芥菜含量31.47%和腌渍芥菜30.96%，并且特征风味物质异硫氰酸酯的含量也高于其他2个，这可能是人工接种二次发酵芥菜香气要好于自然二次发酵芥菜和腌渍芥菜的原因。

通过样品的感官评分可知，样品3（32.5分）＞样品2（26.2分）＞样品1（25.7分），产酸方面，样品3和样品2的总酸含量都达到了0.94%，并且继续发酵总酸含量不再增加，这也说明了总酸含量0.94%是芥菜发酵产酸的终点，样品3达到这个终点的时间只需要5 d，样品2需要7 d。这也说明了人工接种二次发酵芥菜能提高工业上腌渍芥菜的品质，并且和自然二次发酵芥菜比起来，产品品质更优越，发酵时间更短。

3 结论

通过单因素试验和正交试验优化了人工接种二次发酵芥菜的生产工艺，优化工艺是：在室温条件下，分别接种植物乳杆菌和短乳杆菌各4%，发酵时间6 d，产品的综合感官评分达到32.5分。

通过GC-MS分析，腌渍芥菜共检测出挥发性成分89种物质，总含量71.81%，自然二次发酵芥菜共检测出挥发性成分95种物质，总含量69.26%，优化工艺人工接种二次发酵芥菜共检测出挥发性成分93种物质，总含量79.45%。结果表明，腌渍芥菜的挥发性物质种类经过二次发酵有所增加，人工接种二次发酵的腌渍芥菜挥发性物质的总含量最高。

目前工业上的腌渍芥菜风味物质的形成不够完全，加工过程中风味物质还会损失，且总酸（以乳酸计）含量只能达到0.3%～0.6%，需要人工添加乳酸来满足人们对酸菜酸味的要求。利用人工接种乳酸菌在低盐的条件下第二次发酵芥菜可以有效的解决这些问题，人工接种二次发酵芥菜具有产品感官品质好、发酵速度快、酸度达标且酸味比单一添加的乳酸更好，人工接种二次发酵应用于工业化生产是一种可行的办法。

[1]吴方琴，王超，潘苗苗，等.农家酸菜中优质乳酸菌的筛选分离及其产酸性能优化[J].中国酿造，2011，30（10）：100-103.

[2]刘广福，王硕，朱兴旺，等.接种发酵和自然发酵酸菜的亚硝酸盐含量对比分析[J].中国酿造，2013，32（7）：74-76.

[3]赵国忠，王梦颖，韩俊燕，等.东北酸菜品质评定及发酵优良菌株筛选[J].中国酿造，2014，33（8）：33-37.

[4]CHAO S H,WU R J,WATANABE K,et al.Diversity of lactic acid bacteria in suan-tsai and fu-tsai,traditional fermented mustard products of Taiwan[J].Int J Food Microbiol,2009,135(3):203-210.

[5]NGUYEN D T L,VAN HOORDE K,CNOCKAERT M,et al.A description of the lactic acid bacteria microbiota associated with the production of traditional fermented vegetables in Vietnam[J].Int J Food Microbiol, 2013,163(1):19-27.

[6]于新，杨鹏斌，赵美美.腌菜加工技术[M].北京：化学工业出版社，2012.

[7]栾天奇.酸菜发酵剂的制备及酸菜风味成分分析[D].天津：天津科技大学硕士论文，2011.

[8]王娟娟，王顺喜，马微.直投式发酵剂生产酸菜及其风味物质的研究[J].食品科学，2008，29（4）：82-86.

[9]韩国玲，刘安军.东北酸白菜人工接种发酵工艺及挥发性成分的研究[J].食品研究与开发，2010，31（3）：126-129.

[10]方丽，郑明珠.酸菜汁中的乳酸菌的分离与鉴定研究[J].农产品加工·学刊，2010（9）：52-58.

[11]杨晓辉，籍保平，李博，等.泡菜汁中优良乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能的研究[J].食品科学，2005，26（5）：130-133.

[12]王金菊，崔宝宁，张治洲.泡菜风味形成原理[J].食品研究与开发，2008，29（12）：163-166.

[13]夏延斌.食品风味化学[M].北京：化学工业出版社，2008.

[14]袁方.茎用芥菜及其腌制品的挥发性成分分析与感官分析[D].重庆：西南大学硕士论文，2008.

[15]邓静，李萍萍.大头菜腌制过程中挥发性香味物质变化分析[J].食品科学，2013，34（24）：225-229.

CHAO Yuzhou1,2,DENG Fangming1,2*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

In order to improve the flavor of pickled mustard,the artificial inoculation secondary fermentation technology of the pickled mustard was optimized by single factor and orthogonal test.Results showed that the optimal technology wasLactobacillus plantaruminoculum 4%,L.brevisinoculum 4%,fermentation time 6 d,room temperature.Under these conditions,the comprehensive sensory score of the product reached 32.5.The volatile components of pickled mustard,natural secondary fermented pickled mustard and optimal secondary fermented pickled mustard was analyzed by GC-MS.The detection results showed that 89 volatile compounds were detected in pickled mustard,and the total content was 71.81%;95 volatile compounds were detected in natural second fermented pickled mustard,and the total content was 69.26%;93 volatile compounds were detected in the artificial inoculation second fermented pickled mustard,and the total content was 79.45%.The species of volatile components of the pickled mustard increased slightly after second fermentation,and the total volatile components content of the optimal second fermented pickled mustard was the highest.

pickled mustard;fermentation;orthogonal test;volatile compounds

TS255.53

A

0254-5071（2015）04-0035-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.009

2015-03-15

公益性行业（农业）科研专项（201403079）；湖南省现代农业蔬菜产业技术体系专项（2012278）

巢雨舟（1989-），男，硕士研究生，研究方向为食物资源开发与利用。

*通讯作者：邓放明（1962-），男，教授，博士，研究方向为食品科学与工程。