基于响应面法的鲁氏酵母发酵培养基优化

康远军，杨华，李欣，陈雄*，王志

（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

基于响应面法的鲁氏酵母发酵培养基优化

康远军，杨华，李欣，陈雄*，王志

（湖北工业大学生物工程学院，发酵工程教育部重点实验室，工业发酵湖北省协同创新中心，湖北武汉430068）

鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是酱油及酱类生产中风味形成的重要微生物之一。为了获得大量菌体，采用响应面法（RSM）对鲁氏酵母CCTCC M 2013310培养基进行了优化，Plackett-Burman（PB）设计对培养基中相关影响因素的效应进行评价，结果表明，葡萄糖、玉米浆和磷酸二氢钾对生物量影响显著。由中心组合及响应面分析优化确定优化培养基为葡萄糖12.03%，玉米浆2.24%，酵母粉1%，磷酸二氢钾0.26%，甘油3%，VB10.001%。优化培养基的生物量为28.28 g/L，比未优化前提高了4.5倍。

鲁氏酵母；培养基；响应面；优化

在酱油酿造过程中，酵母菌的参与是必不可少的[1]。在酱油形成的中后期，酵母菌发酵糖类物质产酸产醇，并与乳酸菌的代谢产物发生反应[2]。鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是最常见的耐高渗透压酵母，其特点是能生长在含糖量极高的物料中，也能在含18%食盐的基质中繁殖[3]。在制曲及酱醪发酵期间，由空气中自然落入而繁殖的鲁氏酵母占酱醪中酵母总数的45%，它是发酵型酵母，出现在主发酵期。鲁氏酵母的添加工艺已经非常成熟，应用比较广泛，呈味效果已得到公认[4]。

酱油生产后期接入酵母菌进行后熟发酵的技术已推广应用多年，但直接添加酵母菌导致各批次的应用效果差距很大。活性干酵母是由特殊培养的鲜酵母经压榨干燥脱水后仍保持强的发酵能力的干酵母制品，有含水量低，保藏期长、发酵稳定性高的特点[5]。因此开发出利于工业化生产酱油的高活性、高稳定性的干酵母对于制酱企业来说已不容忽视。目前活性干酵母的制备及应用在酿酒和发酵面食加工领域的研究报道较多，而在酱类酿造领域中，活性干酵母的制备及应用研究还很少[6]。响应面法（response surface methodology，RSM）是一种解决多变量问题的统计试验设计方法，在食品、发酵工程等领域有着广泛的应用[7-8]。本研究从辣椒酱中分离得到一株高耐盐性鲁氏接合酵母，对其发酵培养基进行了优化，筛选出了对鲁氏酵母经济可行的发酵培养基，对后期高密度发酵及活性干酵母的制备有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲁氏酵母是湖北工业大学生物工程学院分离保藏菌种，Biolog分子鉴定系统结合生理生化试验，鉴定为鲁氏接合酵母，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，专利保藏号为：CCTCCM2013310[9]。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%（固体培养基中加入2%的琼脂），pH值为6.0[10]。

酵母粉：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨：北京双旋微生物培养基制品厂；氨基酸类：美国Sigma公司；维生素类：武汉华顺生物技术有限公司；其他试剂均来自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

wj-sx700高压灭菌锅：上海博讯有限公司；HNY-200D恒温摇床：天津市欧诺仪器仪表有限公司；DGG-9070A电热鼓风干燥箱：重庆银河试验仪器有限公司；5424R离心机：德国Eppendorf公司；UV-1102可见光分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵方法及培养条件

将实验室保藏的鲁氏酵母CCTCC M 2013310菌种用YEPD斜面活化，恒温培养箱中28℃培养2～3 d。将活化好的斜面接种到YEPD液体培养基，28℃、180 r/min摇床培养30 h，获得液体种子。试验培养基中接入5%的液体种子，于28℃、180 r/min条件下摇床培养20 h。

1.3.2 生物量的测定

细胞干质量测定：取10 mL菌体发酵液于离心管中（离心管提前干燥并称质量），8 000 r/min离心10 min，收集菌体。将收集到的菌体用去离子水洗涤2次，放入干燥箱中于80℃干燥至恒质量，称质量并计算细胞干质量（g/L）[11]。

细胞光密度（OD600nm）测定：菌液发酵液离心后去掉上清液，菌体稀释后于波长600 nm处以去离子水为对照进行比色测定，OD600nm=OD读数×稀释倍数[12]。

1.3.3 碳源单因素试验

在无碳源的YEPD培养基的基础上，分别以2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜和麦芽糖为碳源，选择最优碳源，并考察不同质量分数（5%、10%、15%、20%、25%、30%）的葡萄糖对酵母生物量的影响。

1.3.4 氮源单因素试验

在无氮源的YEPD培养基的基础上，以1%的量添加有机氮源或无机氮源：胰蛋白胨、工业蛋白胨、酵母浸粉、酸水解酪蛋白、玉米浆、氯化铵、硝酸钠和硫酸铵，考察酵母最佳利用氮源。

在不含氮源的简单复合培养基的基础上，考察不同有机氮源含量（1%、2%、3%、4%、5%）对酵母生物量的影响，以及不同无机氮源含量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）对酵母生物量的影响。

选取4%的氮源为总氮源，以玉米浆和酵母粉为复合氮源，添加比例为玉米浆/酵母粉为4/0、3/1、2/2、1/3、0/4；以玉米浆和硝酸钠为复合氮源，玉米浆添加量为4%，硝酸钠添加量分别为0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%。

1.3.5 其他营养物质单因素试验

以碳源及氮源的结果得到初优培养基：葡萄糖20%、玉米浆3%、酵母粉1%和硝酸钠0.5%。分别向初优培养基中添加质量分数为0.1%的磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、硫酸锌、硫酸铁及0.02%的硫酸锰，考察其对酵母生长的影响；分别向初优培养基中添加0.1%的谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，考察其对酵母生长的影响；分别向初优培养基中添加0.001%的硫胺素（VB1）、肌醇、胆碱、泛酸、生物素、核黄素、烟酸、吡哆醛、对氨基苯甲酸，考察其对酵母生长的影响；分别向初优培养基中添加适当浓度的甘油，考察其对酵母生长的影响。

1.3.6 Plackett-Burman试验设计

试选用n=12的PB设计，把每个因素设计成高（+1）和低（-1）2个水平。根据单因素试验结果，结合酵母细胞的生长特点，最终确定葡萄糖（A）、玉米浆（B）、酵母粉（C）、硝酸钠（D）、谷氨酰胺（E）、甘油（F）、磷酸二氢钾（G）、硫胺素（H）这8个因素为PB试验的考察对象。

1.3.7 最陡爬坡试试验设计

根据Plackett-Burman试验结果各显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向，以快速逼近最佳区域。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小确定，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。找到鲁氏酵母产量最高的处理，即为下一步响应面分析的中心点。

1.3.8 响应面分析实验方法

根据最陡爬坡试验结果，显著因素以中心点为零水平，高水平和低水平分别比零水平高于或低于一个实际步长。用Design Expert软件设计中心组合试验并进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

根据表1中的试验结果，不同碳源对鲁氏酵母生物量（OD600nm）的影响差异显著，葡萄糖作为碳源的优势比较明显，因此选择葡糖糖作为碳源。葡萄糖质量分数优化结果表明该鲁氏酵母耐糖性很高，葡萄糖作为单糖是微生物最容易利用的碳源，但过多的葡萄糖会形成Crabtree效应（葡萄糖效应）[13]，抑制菌体的生长，降低葡萄糖的利用率，因此选择葡萄糖的添加量为20%。

氮源试验中，有机氮源酵母粉和玉米浆的OD600nm值达到了11.03和11.01，酵母粉是新鲜酵母自溶浓缩后形成的，含有多种维生素及生长因子能够促进酵母细胞的生长[14]；玉米浆是制玉米淀粉的副产物，含有丰富的可溶性蛋白、氨基酸、还原糖、生长因子和一些前体物质[15]，适于酵母生长；无机氮源是微生物生长的速效氮源，硝酸钠是3种无机氮源中生物量最高的，因此在复合氮源的优化中，选择酵母粉、玉米浆和硝酸钠作为考察对象。在复合氮源试验组中，以3%的玉米浆及1%的酵母粉组成的复合氮源得到的发酵效果最佳，向培养基中添加少量的无机氮源有利于减少发酵过程延滞期的时间，最后以3%玉米浆、1%酵母粉和0.5%的硝酸钠为初优培养基的氮源。

以碳源及氮源的结果得到初优培养基：葡萄糖20%、玉米浆3%、酵母粉1%和硝酸钠0.5%。通过培养基中其他营养物质试验结果及酵母生长特点的分析，确定0.4%谷氨酰胺、3%甘油、0.1%磷酸二氢钾及0.001%VB1添加到初优培养基进行PB试验。

2.2 Plackett-Burman试验结果

按Plackett-Burman试验设计进行试验，把每个因素设计成高（+1）和低（-1）2个水平，高水平是低水平的1.25倍。PB试验设计及响应值（鲁氏酵母OD600nm值）结果见表2，各因素水平及显著性分析见表3。

由表3可看出，酵母粉、硝酸钠、磷酸二氢钾、VB1表现为正效应，葡萄糖、玉米浆、谷氨酰胺、甘油表现为负效应。可信度＞95%的因素为葡萄糖、磷酸二氢钾，表现为极显著。玉米浆的贡献值排在第3位，可信度＞90%。因此确定葡萄糖、磷酸二氢钾、玉米浆为主要影响因素进行下一步试验。考虑到鲁氏酵母不能利用硝酸盐，在后续实验中不再添加硝酸钠。

2.3 最陡爬坡试验

根据根据表3分析结果，显著因素的变化步长及方向的试验设计及结果见表4。

从表4可以看出，最佳因素组合在第2组。但是随着葡萄糖浓度的下降，1～5组的细胞产量很接近，细胞对葡萄糖的得率下降。较低的葡萄糖含量有利于酵母的生长，因此选择第5组的水平作为响应面的中心点，即葡萄糖12%、玉米浆2.2%、KH2PO40.26%。

2.4 响应面分析的试验设计及结果

根据最陡爬坡试验确定了重要影响因素的取值的区间。利用Design Expert进行中心组合的试验设计，对鲁氏酵母发酵过程中的关键因素做进一步的研究和探讨，将最陡爬坡试验中的3个因素葡萄糖含量、玉米浆含量、KH2PO4含量分别标记为X1、X2、X3，以鲁氏酵母发酵20 h后OD600nm值（Y）作为响应值，试验因素与水平见表5，设计及结果见表6，回归模型方差分析结果见表7。

根据表6试验结果通过Design-Expert软件进行响应面分析，建立多元二次回归方程如下：

由表7可知，模型大于F值的概率P＜0.01，表明模型非常显著对响应值Y的影响非常显著，可信度较高；模型的二次项对鲁氏酵母产量的效应影响非常显著（P＜0.01），交互项X2X3较为显著；模型失拟项的P值为0.373 4，表明模型符合实际情况，可以用此模型对鲁氏酵母的产量进行分析和预测。

2.5 最适培养基组成的确定及验证试验

根据上述回归方程绘出响应面分析图，以确认葡萄糖、玉米浆、KH2PO43个因素对鲁氏酵母产量的影响，响应面图见图1。

由图1可知，该方程的抛物线图形开口均向下，说明方程存在最大值，即响应面范围覆盖了最大值所在的区域。由Design Expert软件分析得到最适培养基中葡萄糖、玉米浆和KH2PO4所对应的实际值分别为12.03%、2.24%、0.26%。由此可知，最适培养基组成为葡萄糖12.03%，玉米浆2.24%，酵母粉1%，磷酸二氢钾0.26%，甘油3%，VB10.001%。预测在此组成条件下发酵20 h鲁氏酵母生物量最大，OD600nm值为38.717 4。

使用上述培养基进行鲁氏酵母发酵培养的验证试验，结果见图2。由图2可知，鲁氏酵母在优化培养基的生长曲线20 h时的OD600nm值在40左右，与预测值相近，经过24 h鲁氏酵母生长达到稳定期，最大OD600nm值为59.125，对应的细胞干质量为28.28 g/L，优化前的YEPD培养基最大细胞质量为5.12 g/L，优化培养基比YEPD培养基细胞干质量提高了4.5倍。

3 结论

根据单因素试验结果，确定最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母粉和玉米浆。部分因子试验表明葡萄糖、玉米浆和磷酸二氢钾对生物量的影响显著。经中心组合试验设计及响应面分析，确定了优化培养基组成为葡萄糖12.03%，玉米浆2.24%，酵母粉1%，磷酸二氢钾0.26%，甘油3%，VB10.001%。建立了以生物量为响应值的二次模型：Y=38.685-0.065 4X1+0.350 9X2-0.036 1X3+0.363 2X1X2+ 0.6878X1X3+1.414 1X2X3-2.208 8X12-1.212 8X22-1.542 2X32。验证试验结果证明了该模型的正确性，经过24 h鲁氏酵母生长达到稳定期，最大OD600nm值为59.125，对应的细胞干质量为28.28 g/L，优化前的YEPD培养基最大细胞干质量为5.12 g/L，优化培养基细胞干质量比未优化前提高了4.5倍。

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KANG Yuanjun,YANG Hua,LI Xin,CHEN Xiong*,WANG Zhi

(Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Key Laboratory Fermentation Engineering Ministry of Education,College of Bioengineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Zygosaccharomyces rouxiiis one of the important microbe in the flavor formation of soy sauce and other sauces production.In order to obtain more biomass,response surface methodology was used to optimize fermentation medium composition forZ.rouxiiCCTCC M 2013310.Plackett-Burman design was used to evaluate the influence of related factors on medium.The results of PB design indicated that contents of glucose,corn steep liquor and KH2PO4affected the biomass significantly.The optimum medium was obtained with central composite design and response surface analysis method as follows:glucose 12.03%,corn steep liquor 2.24%,yeast extract 1%,KH2PO40.26%,glycerol 3%,VB10.001%.The maximum cell mass in optimum medium was 28.28 g/L,improved 4.5 times than the non-optimized one.

Zygosaccharomyces rouxii;medium;response surface methodology;optimization

TQ925

A

0254-5071（2015）04-0025-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.007

2015-04-03

湖北省自然科学基金重点项目（No.2012FFA058）；武汉市重点科技攻关项目（No.201220822278-1）

康远军（1990-），男，硕士研究生，研究方向为酿造工程。

*通讯作者：陈雄（1969-），男，教授，博士，研究方向为酿造工程。