基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测试剂申报资料要求

【作 者】韩昭昭

国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京市，100044

基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测试剂申报资料要求

【作 者】韩昭昭

国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心，北京市，100044

该文旨在阐述基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测试剂的申报情况及检测试剂注册申报资料的技术要求。通过介绍该类试剂的申报情况，分析该类试剂的注册申报资料中常见问题，对检测试剂的预期用途、参考品和质控品的设置、分析性能评估、参考区间的研究及临床评价等部分注册申报资料要求进行解析。

第二代测序技术；注册申报；分析性能；技术审评；临床评价

染色体疾病是由于先天性染色体数目异常或结构异常而引起的具有一系列临床症状的综合征，表现为先天性智力低下，生长迟缓及多发畸形等。染色体病约有数百种，其中最常见的有60多种。在自然流产胎儿中有20%～50%是由染色体异常引起；在新生活婴中染色体异常的发生率为0.5%～1%[1]，其中21-三体综合征（唐氏综合征）、18-三体综合征（爱德华氏综合征）和13-三体综合征（帕陶氏综合征）是三种最主要的染色体疾病。我国目前每年有数万例染色体异常患儿（合并各种异常和畸形）出生，大大降低了人群健康水平和人口素质，且因治疗、残疾和死亡导致的疾病给社会带来了巨大的负担。有效的产前诊断可以降低围生儿的死亡率，且可以通过对出生缺陷患儿的早期干预，明显改善生存质量。

目前主要通过对母血中甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素β亚基、游离雌三醇等多生化指标联合检测对胎儿染色体病进行筛查，染色体核型分析为确诊的染色体病的主要方法[2-3]。染色体核型分析为侵入性产前诊断，主要采用细胞培养和染色体G显带分析，这种方法存在由于细胞培养失败、细胞生长较差、染色体可分析核型过少或形态较差，造成核型分析失败的情况和导致流产及胎儿肢体畸形风险。母体血浆中存在的胎儿游离DNA的发现和高通量测序平台的诞生，为对传统侵入性产前检测有疑虑或风险不可接受的高危孕妇提供了一种新的选择。

1 注册申报情况

2014年6月30日，国家食品药品监督管理总局，批准了首批第二代基因测序诊断产品，包含两个基因测序仪和两个配套胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒。之后有多家公司进行同类仪器及配套试剂的注册申报并陆续批准上市。第二代基因测序属于微循环阵列合成测序，采用大规模矩阵结构的微阵列分析技术，利用DNA聚合酶或连接酶及引物对末班进行一系列的延伸，通过显微技术观察记录连续循环中的光学信号来实现测序，可以同时并行分析阵列上的DNA样本[4]。就目前申报及已批准上市的第二代测序产品来说，胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒的配套仪器主要为各申报单位基于Illumina公司和AB Life Technologies公司技术自行生产的第二代测序平台。

由于第二代测序技术相对其他检测技术问世时间较短，技术较为复杂，因此对于本类检测试剂而言，

目前要求试剂申请需在配套仪器批准上市后进行，或试剂与配套仪器同时进行注册申报。目前国际主流的第二代测序平台还未在国内批准上市，甚至未在原产国批准上市，因此限制了大批国内试剂生产商的申报，预计将来主流第二代测序平台上市后，会有大量的相关检测试剂进行注册申报。

2 预期用途

根据目前国内和国际的普遍认知[5]，建议将本类试剂的预期用途定义为：用于定性检测孕妇外周血浆中胎儿游离脱氧核糖核酸（cell-free fetal DNA, cffDNA）。通过分析样本胎儿游离DNA的染色体数量的差异，对胎儿染色体非整倍体疾病进行产前辅助诊断。由于目前该类检测并未在所有人群中进行充分的评估，因此目标人群应仅限于高危、单胎孕妇。高危孕妇的定义参考相关卫生行业标准[2-3]。另外还需结合胎儿cffDNA浓度规律及目前常规产前诊断的标准日程安排，明确对待检孕妇孕周的要求。

3 参考品和质控品的设置

本类检测试剂项目目前已有国家参考品（高通量测序用外周血胎儿染色体非整倍体T21、T18和T13），根据《体外诊断试剂注册管理办法》规定，申报注册产品在临床评价前应采用国家参考品进行注册检测。然而注册检测不能有效控制每批产品的质量，因此企业还需重视对企业内部参考品的建立，建议企业参考国家设置项目设置内部参考品，至少包含阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性质控品。其中阳性参考品和重复性参考品应包含特定浓度的T13、T18、T21阳性参考品，阴性参考品除正常孕妇血浆游离DNA外，还应包含其他染色体非整倍体参考品。

建议在试剂盒中配置合理的质控品以确保检测结果有效可靠。对于本类检测项目由于发病率较低，同一检测中样本检出全部为阳性的概率极低，此时同一检测中的正常样本可起到阴性对照的作用，因此对于本类检测试剂，试剂盒中可仅设置阳性质控品。为更好的监控检测体系，阳性质控品建议设置为弱阳性浓度水平，且包含全部三种待测三体异常样本，质控品可以三只单独或三种混合的形式包装。

4 分析性能评估

分析性能评估资料是注册申报资料的重要技术资料，申请企业应详细编写此部分内容，对于本类产品除常规的评估项目外，还应包括以下内容：

(1) 对提取试剂的验证，其中至少包含提取效率、提取重复性及提取抗干扰能力的研究；

(2) 对企业内部参考品的检测、对微缺失微重复和嵌合体样本的检测、对异位样本的检测；

(3) 内源性物质的定量干扰试验；(4) 胎儿DNA样本含量的研究；(5) 测序Reads量的研究资料。

5 参考区间的研究

采用大样本量的正常女性孕妇血浆游离DNA进行参考区间研究，样本应有明确的临床检测结果及清晰的来源。计算阴性样本的Z值，并根据样本分布情况选择合理的统计学方法，计算参考区间。选择一定数量经确认的T13、T18和T21阳性血浆DNA临床样本对参考范围的进行验证，验证参考区间的合理性。对落入参考区间内可能出现的阳性情况进行讨论；给出合理的灰区范围并对检测出现灰区样本的处理方法进行合理的建议。

对于本类产品Z值并非直接检测得出数值，它是一个计算比值，是检测样本中特定染色体比例与参考人群特定染色体比例平均值的标准偏差。其中参考人群中特定染色体的比例平均值及对应的染色体比例标准偏差，是由各个生产企业经前期研究制定的，因此还需要在参考区间的研究资料中对这部分研究进行详细的阐述。

6 临床评价

鉴于三体综合征的发病率相对较低，建议临床评价总例数应不少于10 000例，其中包括回顾性研究8 000例、前瞻性研究2 000例。样本入组标准以及诊断标准依据卫生部发布的WS 322.2-2010《胎儿染色体产前诊断技术标准》进行，以羊水穿刺核型分析和/或出生随访结果作为对照金标准。回顾性研究是指对临床研究单位样本库中已有金标准确认的样本，使用该检测系统进行重新检测，其结果与原金标准结果进行对比分析。前瞻性研究是指对临床需要正常进行产前诊断的高危孕妇采集样本中的样本与金标准检测进行对比分析，要求应能检测出T13阳性病例，检测出至少5例T18阳性病例以及有具有统计学意义例数的T21阳性病例。如进行前瞻研究的2 000例之中未出现规定例数的阳性病例，则应继续增加样本例数直至符合最低例数样本要求。

对于临床试验中由于核型分析的细胞培养不出导致金标准检测数据缺失进而造成数据失访时，失访率

应控制在≤5%，且失访数据应说明原因。

检测试剂的临床评价资料中，回顾性样本大多以跟踪随访为金标准方法，然而随访研究中存在规范性较差，且各家医院方案不同的现象。鉴于目前我国新生儿出生随访无权威的方案与规范，建议临床评价采用出生随访作为回顾研究金标准方法的研究者，临床评价前协调所有临床试验机构，制定清晰、合理统一的临床试验方案，使得临床评价更加科学合理。

基于第二代测序技术的胎儿染色体非整倍体检测为那些对传统有创产前检测有疑虑或认为风险不可接受的孕妇的产前诊断提供了新的选择。此类检测试剂的临床定位应建立在充分的研究实践基础上，性能评估应结合产品的特性进行。另外申报企业应重视对检测试剂企业内部参考品和试剂盒内质控品的设置；建议选择大量样本利用合理的统计学方法设置参考区间。临床评价应选择目标人群进行，并对一定数量的前瞻样本进行研究。本文仅针对此类试剂盒的部分申报资料提出建议，目前该类产品的申报数目较少，审评经验不足，随着该类产品的发展以及管理法规的建立和完善，对此类试剂临床试验研究的要求将更加合理可行。

[1] 陈竺. 医学遗传学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2002.

[2] 中华人民共和国卫生部. WS 322.1—2010 胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准 第1部分: 中孕期母血清学产前筛查[S].

[3] 中华人民共和国卫生部. WS 322.2—2010 胎儿常见染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准 第2部分:胎儿常见染色体异常的细胞遗传学诊断技术标准[S].

[4] 周晓光, 任鲁凤, 李运涛, 等. 下一代测序技术:技术回顾与展望[J].中国科学:生命科学, 2010, 40(1): 23-37.

[5] The American college of obstetricians and gynecologists committee on genetics, the society for maternal-fetal medicine publications committee. Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy[S]. 2012.

共聚聚酯应用互动技术平台Tritan Mold It

近年来，美国伊士曼化工公司推出新一代共聚聚酯 ——TritanTM。由于它具有优良的机械物理性能，如高抗冲击强度；优良的耐化学性，不含BPA，良好的生物相容性；高透明度与良好的加工成型性。自推出市场以来，已经在家居用品、小家电中的耐用品以及医疗器械（留置针、透析器）等领域得到广泛应用。

然而，TritanTM材料在加工工艺与模具设计方面有一定的特殊要求，为了帮助用户顺利地采用TritanTM材料来开发各种品质优良的产品，快速地掌握TritanTM的特性与加工工艺，日前伊士曼公司推出的Tritan Mold It在线互动技术平台（www. tritanmoldit.com）。这是一个专为注塑商所提供的资源共享平台，以协助伊士曼公司的客户快速开发新产品。注塑企业可以通过该平台找到丰富的Tritan产品技术资料和加工指南，并在网站的论坛版块分享注塑经验。Tritan Mold It 特别设有“向专家提问”栏目，所提出的技术问题将在24小时内得到回复。

Tritan Mold It是一个面向采用伊士曼公司TritanTM共聚聚酯材料的注塑企业的互动在线平台，共有中、英、日、韩四种语言。它可在线帮助注塑商深入地了解如何加工TritanTM材料：如何优化加工设备，尽可能降低使用模具加工TritanTM材料的难度，生产出能够满足客户需求的产品。同时帮助用户提高流程效率，降低能耗和废品率，从而提高经济效益。

（本刊讯）

Ideas about Registration for Prenatal Diagnosis of Chromosome Aneuploidy by Next Generation Sequencing Technology

【Writer】HAN Zhaozhao
Center for Medical Device Evaluation, CFDA, Beijing, 100044

To review the registration and technical data for prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy by next generation sequencing technology. On the basis of introducing declarations of the reagents, analysis registration dossier common problems. And analysis the requirement of performance evaluation, reference intervals and clinical evaluation study.

next generation sequencing, registration, evaluation performance, technical review, clinical evaluation

F203

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.03.015

1671-7104(2015)03-0209-03

2015-02-03

韩昭昭，E-mai: phemily@126.com