浅谈适用于医疗器械眼刺激试验的体外替代方法

田胜慧 柯军 林美琼 颜林 广东省医疗器械质量监督检验所 （广州 510663）

0.前言

眼刺激性是指眼睛前表面直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化。检测化学物刺激性的传统实验，是1944 年由Draize 等提出的兔眼实验（Draize 试验），是测定急性眼刺激性的国际标准。眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行眼刺激性试验，并将其作为常规方法应用于化妆品原料及成品，医疗器械产品及眼用包装容器等的安全性检测中。 Draize 试验作为眼部安全评价标准已逾几十载，通过观察眼部组织受损伤的程度（如结膜充血、睫状充血、泪液分泌等，并应用萤光素钠观察角膜透明度的变化）来测定受试物刺激性的大小。

但此方法不仅对动物造成痛苦，而且成本高，周期长，评分系统主观以及动物外推至人的种属差异等缺点。加之近年来随着“3R”（Reduction，Refinement，Replacement）原则的实施，动物福利日趋受到重视，兔眼刺激性试验在伦理上和科学上均受到质疑。因此，应用体外替代试验，减少、优化和替代动物试验已迫在眉睫，欧盟及多个国家已开展了有关兔眼刺激性试验的替代方法研究，一些已经获得验证和认可。目前，替代方法的研究主要集中在化妆品、化妆品原料以及农药检测等领域，而关于医疗器械方面的报道却很少。本文将对体内眼刺激试验的发生机制，现行可供选择的眼刺激试验替代方法，以及其中适用于医疗器械领域的替代方法和有关这方面的研究做简要介绍。

1.眼刺激发生机制

眼睛的前表面被角膜和结膜覆盖，角膜是最暴露的区域，因此，也是最有可能直接接触刺激物的部分。在Draize 试验中，角膜损伤占眼毒性总分的73%，因此，角膜的损伤程度可以预测眼睛的最终损伤程度，而受试物自身的细胞毒性是造成角膜损伤的最主要原因。许多轻度刺激物只影响角膜上皮的表层细胞，而角膜可以在短时间内修复这种类型的损伤；轻度和中度刺激物的影响主要是上皮细胞和表面的基质；重度刺激物能穿透更深层的基质，甚至造成不可逆的损伤[1]。

角膜损伤程度（细胞损伤）和大体观察的相关性，为开发和验证体外眼刺激试验的替代方法提供了机理性基础。结膜反应通常先于角膜反应，轻微眼刺激通常只对结膜产生作用而对角膜没有影响，角膜损伤与中度和重度刺激反应有关[1,2]。引起细胞膜裂解或蛋白质凝集的物质可产生急性细胞毒性，表面活性剂和一些有机溶剂是这类物质的典型。作用于细胞能量代谢的物质也可产生急性细胞毒性，但没有第一类物质迅速。化学物质还可以通过对大分子的烷基化或者其他修饰而发挥作用，表现为一种迟发性的细胞毒性（如迟发性坏死或凋亡）。

2.眼刺激试验的替代方法

目前关于眼刺激试验的替代方法主要分为以下几类[3,4]：

2.1 离体器官试验

指利用离体眼球或角膜与受试物接触，通过检测角膜水肿、通透性以及渗透性等指标的变化来判断眼刺激性的体外方法。包括：BCOP （Bovine Corneal Opacity and Permeability，牛角膜浑浊和渗透性试验）；IRE（isolated rabbit eye test，离体兔眼试验）、ICE（Isolated Chicken Eye，离体鸡眼试验）等。2009 年，BCOP、ICE 和IRE 方法被OECD 正式认可，可作为Draize 试验的替代试验。此类试验适用于重度眼刺激性物质的筛选，但对轻度刺激性物不敏感，不能作为区分刺激物和非刺激物的确认试验。

2.2 以细胞毒性为基础的试验

应用细胞毒性试验来评估受试物潜在的眼刺激性是基于一些研究表明，对眼睛产生损伤的材料（包括作用在眼的上皮和内皮组织中的材料），能在不同类型的细胞中产生细胞毒性效应。 包括：NRU（neutral red uptake assay，中性红摄取试验)；NRR（neutral red release assay，中性红释放试验）；RBC（red blood cell haemolysis test，红细胞溶血试验）。NRU 试验，通过检测受试物抑制细胞摄取中性红染料的能力来评价眼刺激性，中性红摄取能力是细胞活性的标志。常用于NRU 试验的细胞包括：中国仓鼠V79 细胞，正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes, NHEK），BALB/c 3T3 小鼠成纤维细胞和兔角膜上皮细胞系。NRU 试验对于检测表面活性剂与体内试验有很好的相关性。因此，NRU 试验更适合于评价轻度刺激物，表面活性剂类以及基于表面活性剂的配方类物质，比如洗发水等。 NRR试验是NRU 试验的变体，同样适用于评价表面活性剂类个人护理产品，适用于区分非刺激物和轻度刺激物。RBC 试验，该试验是基于化学物质能损伤细胞膜的原理设计，通过测量标准条件下与受试物孵育的新鲜分离的红细胞中血红蛋白渗漏量的吸光值来评估试验结果。氧合血红蛋白（oxyhaemoglobin, oxyHb）变性作为第二毒性终点。哺乳动物红细胞容易获得，因此RBC 试验可减少眼刺激试验的动物使用。RBC 试验主要适用于表面活性剂类物质的检测，受试物可为水溶性和疏水性。

2.3 基于鸡胚绒毛尿囊膜的试验

指利用鸡胚绒毛膜尿囊膜结构与人结膜相似的特点，通过检测出血、充血、凝血等指标的变化来评价受试物的眼刺激性。包括: HET-CAM（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membrane, 鸡胚绒毛膜尿囊膜试验）、CAMVA（Chorioallantoic membrane vascular assay，绒毛膜尿囊膜血管试验）、CAM-TB（chicken chorioallantoic membrane - trypan blue staining，绒毛膜尿囊膜苔盼蓝染色试验）。CAM-TB 是经过改进的HET-CAM 方法，通过测定CAM 吸收台盼蓝的量来检测受试物损伤作用，克服了其缺乏客观性和难量化的缺点。结果表明该方法比HET-CAM 实验方法变异性低，而且和Draize 试验最大平均分值（maximal average score, MAS）有很好的相关性。但有色物质可能干扰终点的测定。在行业内，HET-CAM试验可作为确定眼刺激性的筛选方法，用于配方或原材料的安全性评价中，确定可能的非刺激物或轻度刺激物，有效的减少了动物试验。COLIPA和美国CTFA 等在内的多个机构的研究结果表明，CAMVA 方法和兔眼刺激实验的最大平均分值(MAS)值有很好的相关性，可正确将受试物分类为刺激物和非刺激物。COLIPA 的研究结论表明CAMVA 更适合检测水醇类物质，而HET-CAM更适合检测表面活性剂或含有表面活性剂的配方类物质[5]。总体上讲，此类方法适合作为化妆品和个人护理用品配方、醇类物质和表面活性剂的筛选。适合用于评价轻度到中度范围的刺激性物质，但不能用于严重刺激性物质的分类。

2.4 以细胞功能为基础的实验

如荧光素漏出试验（fluorescein leakage test，FL）。此试验是基于以下原理设计，角膜上皮可以做为潜在危险化学物质的“不透水层”，但当其结构被破坏时就会产生眼刺激。 在FL 试验中，用体外培养的贴壁细胞模仿角膜上皮，这些细胞之间可以形成紧密连接和桥粒结构，类似于“不透水层”。FL 试验适用于筛选从轻度到中度刺激范围类物质，并且仅适用于液体或能溶解在水或轻矿物油类物质，但其结果的重复性需要进一步的验证。

2.5 基于重组的人角膜组织模型进行的试验

指利用体外培养的类角膜组织模型评价受试物的眼刺激性。主要有美国MatTek 公司生产的EpiOcular 模型和法国SkinEthic 实验室开发的SkinEthic™HCE 模型。目前该类方法已在化妆品、个人护理、日化和化工等领域使用，此外，还用于产品配方（轻至中度眼刺激性）的临床前安全性检测，以及用于配方优化、表面活性剂及其配方（个人和家庭护理用品）的安全性评估等。

3.适用于医疗器械的替代方法探讨

药用滴眼剂瓶的材料多数为聚乙烯、聚丙烯、聚酯等高分子化合物，属于低毒性或无刺激性化合物。因其包装的药品与眼部组织直接接触, 而包装材料中的各种添加剂可能溶出, 从而对眼产生刺激性作用。YBB00062002 国家低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶包装标准和YBB00072002 聚丙烯药用滴眼剂瓶的包装标准中[6,7], 将眼刺激实验作为重要的生物性能评价指标。隐形眼镜护理液的安全性评价一般依据GB 19192-2003：隐形眼镜护理液卫生要求[8]，其中眼刺激性按中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》（第三版）第一分册《实验技术规范》1999“消毒剂毒理学实验技术”进行检测。根据隐形眼镜护理液卫生标准，直接与眼接触的产品原液或使用液均应进行眼刺激试验，且应达到无刺激性的合格标准。

标准GB/T 16886.10 – 2005 和ISO 10993-10：2002 中[9,10], 对于眼刺激实验的总则规定: 只有在其他方法不能得到安全性数据的情况下才考虑进行体内实验。31 版美国药典中规定, 眼用制剂的包装材料只需要进行细胞毒性的检测。因此，在医疗器械领域使用体外方法也将是一种趋势。研究开发适用于医疗器械的眼刺激替代方法，对于保证药品包装材料和隐形眼镜护理液等的安全, 并且符合国际国内法规和标准的要求是极其重要的。替代方法的研究主要集中在化妆品、化妆品原料以及农药检测方面，眼用制剂则未见报道。

医疗器械类产品（药用滴眼剂瓶和隐形眼镜护理液）多属于轻度或无刺激性物质，因此在考虑此类产品的替代方法时，应选择筛选范围在无刺激性到轻度刺激性的方法，比如HET-CAM，CAMVA 等。但是，不同替代方法都有其局限性，比如HET-CAM 适于表面活性剂类物质，CAMTB 不适于有色类物质的筛选。而CAMVA 试验不仅可以检测有色物质，还可以检测固体以及不溶性物质，可以考虑使用此方法来检测医疗器械类产品的眼刺激性。总之，在选择替代方法时，首先，要考虑到各体外方法的试用范围及其局限性；其次，要充分了解受试物的理化性质，以及可能产生眼刺激性的机理。

大多数的隐形眼镜护理液的有效成分是表面活性剂，可能通过破坏膜的完整性，导致膜溶解而产生眼刺激，因此，我们可以考虑用NRU，RBC，HET-CAM 等方法来评估其刺激性。药用滴眼制剂包装材料多为聚烯烃类，属于轻刺激或无刺激类物质，标准要求应对眼无刺激。李向辉等采用短时暴露（short time exposure, STE）方法检测兔角膜上皮细胞的细胞毒性[11]，探讨其取代Driaze 试验的可行性。STE 实验的灵敏度和特异性分别为100%和80%，假阳性率为20%，假阴性率为0%。研究认为，STE 试验有潜力作为眼用制剂包装材料的兔眼刺激试验的替代方法，可以作为组合实验的一部分或初筛试验。

4.小结

相对于化妆品眼刺激试验替代方法的研究而言，关于医疗器械眼刺激试验替代方法的报道却很少。从2013 年3 月起，欧盟委员会下令禁止用动物对化妆品的安全性进行测试，禁止销售任何用动物进行测试过的化妆品，包括化妆品成分。在医疗器械领域减少动物的使用，甚至完全替代动物试验也将是一种趋势，因此，开发和研究适用于医疗器械安全性评价的体外替代方法势在必行。

[1] Maurer, J.K., Parker, R.D., and Jester, J.V. Extent of initial corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Regulatory Toxicology and Pharmacology, 2002, 36:106-117.

[2] Jester, J. Extent of corneal injury as a biomarker for hazard assessment and the development of alternative models to the Draize rabbit eye test. Cutan. Ocul. Toxicol, 2006, 25, 41–54

[3] 敖华英综述，程树军审核. 化妆品眼刺激性及替代方法. 广东检验检疫技术中心, 中国替代方法研究评价中心. 2011

[4] 张文改，杨杏芬. 眼刺激试验的替代方法及应用策略研究进展[J]. 华南预防医学, 2007, 33(1):27-30.

[5] Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.G., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah,P.V., Curren, R.D., Miller, K. A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fund. Appl. Toxicol, 1995, 26, 20–31.

[6] YBB00062002 国家低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶包装标准

[7] YBB00072002 国家聚丙烯药用滴眼剂瓶的包装标准

[8] GB 19192-2003：隐形眼镜护理液卫生要求

[9] GB/T 16886.10 – 2005, 医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与迟发型超敏反应试验

[10] ISO 10993-10：2002, Biological evaluation of medical devices - Part 10: Tests for irritation and skin sensitization

[11] 李向辉，邱璐，邱知红. 兔角膜上皮细胞短期暴露实验替代兔眼实验的可行性研究[J]. 药学服务与研究, 2009, 9(3):182-185.