大型真菌原生质体的制备与再生研究

李晶莹，孙婷婷，张国权，邹莉

(东北林业大学，哈尔滨150040)

大型真菌原生质体的制备与再生研究

李晶莹，孙婷婷，张国权，邹莉*

(东北林业大学，哈尔滨150040)

综述了多种大型真菌原生质体分离和再生技术，并分析了各因素对原生质体分离和再生的影响，为今后大型真菌的菌种选育和转基因研究提供理论基础。

大型真菌；原生质体；分离；再生

大型真菌营养丰富，药用价值突出，自古以来深受人们喜爱，其主要包括食用菌和药用菌两部分。食用菌含有丰富的糖类、多种蛋白质、维生素和不饱和脂肪酸，味道鲜美，保健功能强。如木耳清爽可口，是“素中之荤”；香菇味道独特，是“菇中之王”；金针菇口感清脆，小孩常食，能增强智力；猴头菇不仅味道鲜美，更能养胃；双孢蘑菇色质白嫩，肉质鲜美，营养丰富，是人们喜爱的菌类之一。药用菌具有抗肿瘤、调节免疫力、保肝解毒、降血脂、抗血栓、抗辐射、抗菌、抗病毒、抗衰老等作用，对癌症、肿瘤、肝脏疾病、心血管疾病等多种常见疾病均有治疗保健作用，还能延缓衰老、美容养颜，提高人体免疫力[1]。如桑黄具有抗发炎、抑制肿瘤生成、抗氧化、增强免疫力，保护肝脏等作用；茯苓具有健脾和胃、宁心安神等功能，是中药“八珍”之一，茯苓多糖对多种癌症和肿瘤具有不同程度的抑制作用；冬虫夏草可保肺肾、补精髓、化痰止劳咳；灵芝的提取物对高血压、血管硬化、脑血栓、气管炎及癌症均有疗效；桦褐孔菌精粉对糖尿病有特殊的疗效；樟芝具有抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、保护肝脏等作用，可促进肝细胞再生[2-3]。除此之外，裂褶菌、灰树花、槐耳、层卧孔菌等对多种疾病都有特殊疗效[4]。

然而大型真菌的产量不高，尤其是稀有食用菌和珍贵药用菌，其有效成分的提取量更少，为此人们愈来愈多地使用原生质体技术如原生质体融合、原生质体诱变、原生质体再生育种、原生质体转化来获得优良菌株，而原生质体制备和再生是原生质体技术的前提和基础。本文通过总结了多种大型真菌原生质体分离和再生条件，并分析了各因素对原生质体分离和再生的影响，为今后大型真菌的菌种选育和转基因研究提供科学依据。

1 原生质体制备

早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想，目前人们主要采用酶法来制备原生质体[5]。常用的酶有溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶和崩溃酶等。

1.1 菌龄对原生质体制备的影响

菌龄不同，菌丝体的细胞壁成分和结构不同，代谢也不同。菌龄短的菌体细胞壁成分相对简单，且较薄；随着菌龄增大，则相反，其次生代谢物增多，酶解壁难度增加。菌龄过短，菌丝量不足，也影响原生质体得率[6]。因此，选择在适宜的时期对菌丝进行酶解反应是十分必要的。梁清乐，郭成金等[7-8]认为菌丝对数生长期是原生质体释放最适合的菌龄。

1.2 不同酶对原生质体制备的影响

真菌的细胞壁成分主要由几丁质、甘露聚糖、葡聚糖等组成，其成分复杂。通常使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好[9]。姜波[10]通过对虫草菌原生质体的制备及诱变研究，发现溶菌酶与纤维素混合酶处理菌丝体时形成的原生质体质量最好，达到1.145×107个/mL。张卉等[11]通过对姬松茸原生质体形成和再生研究，发现溶壁酶+蜗牛酶+纤维素酶组成的酶系统效果最好。祝子坪等[12]通过对桑黄原生质体的分离与再生研究，发现溶壁酶+崩溃酶的组合酶系的酶解效果最好。

1.3 不同酶液浓度对原生质体制备的影响

制备原生质体所使用的酶液并不完全纯化，其含有杂质酶，如溶壁酶(广东微生物研究所)就含有核糖核酸酶和蛋白酶，这些酶对原生质膜有损害作用[13]。一定范围内，酶浓度越高，原生质体的产量也越大，当酶的浓度超过一定值后，原生质体的质量开始下降，甚至急剧下降，这就是杂酶所造成的。并且，酶浓度过大，原生质体脱壁太彻底，再生也会受到严重影响[5]。吕龙等[14]通过正交设计法探讨茯苓原生质体的最佳制备条件发现，酶解1 h茯苓原生质体的产量最高；2 h茯苓原生质体的数量迅速下降；之后茯苓原生质体的数量又逐渐增多，他分析可能是所用酶液浓度较高，菌丝体的菌龄较小，所以酶浓度和菌丝体的菌龄对原生质体制备具有严重影响。此外，有研究表明高浓度的酶对原生质体有一定的损伤[15-16]。

不同菌丝的细胞壁组成差异显著，酶解所需的酶液浓度也随之变化。王淑珍等[17]发现用2.5%溶壁酶+0.5%崩溃酶酶解松茸菌丝体得到原生质体的效果较好；曹文芩等[18]等发现使用3%的溶壁酶和蜗牛酶的混合液酶解灵芝菌丝获得原生质体的效果最好；张丽霞等[19]发现使用2%溶壁酶酶解猪苓菌丝得到原生质体的效果较好。

1.4 不同渗透压稳定剂对原生质体制备的影响

常用的渗透压稳定剂主要是无机盐、糖类或醇类，如氯化钠，氯化钾，氯化钙，硫酸镁，蔗糖，葡萄糖，甘露醇等。渗透压稳定剂常用浓度为0.5～0.6mol/L[17]。渗透压稳定剂能够维持原生质体内外渗透压平衡，对原生质体形态和活性有着重要作用，然而不同原生质体最适的渗透压稳定剂也不同。郭成金等[8]通过利用正交试验对冬虫夏草原生质体的制备与再生的研究，发现糖醇类物质黏度过高，大大降低或抑制了酶的反应活性，而以0.6mol/L的KCl作渗稳剂，则有助于酶与底物的结合，对酶解反应起促进作用。李刚等[20]发现硫酸镁很易和琼脂反应产生大量沉淀，从而难以凝固或凝固后仍有较高的流动性，妨碍再生实验的进行。

1.5 不同酶解温度对原生质体制备的影响

酶促反应深受温度的控制，在不同温度下，酶活性不同，酶解效果也不同。低温会降低酶促反应速率，而高温可能会降低酶活性和损伤已游离的原生质体[19]。溶壁酶的最适酶解温度为25～35℃，而每克菌丝细胞经30～40mg蜗牛酶在37℃下保温1h即可溶解细胞壁，破壁率达90%以上。不同菌类、不同的酶，其最适酶解温度不同[6]。邹莉等[21]发现在32℃条件下用溶壁酶酶解，亚侧耳原生质体的产量最高。勾丽莉等[22]发现在34℃条件下，用1.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶酶解，血红铆钉菇原生质体的产量最高。王谦等[23]发现在25℃，1%蜗牛酶+1%纤维素酶条件下酶解，玉蕈原生质体产量最高，高于或低于25℃，原生质体产量都会降低。另外，原生质体活力最高时的温度并非产量最高时的温度[24]。

1.6 不同酶解时间对原生质体制备的影响

一般地，随着时间的延长，有越来越多的菌丝被酶解，释放出球状的原生质体，但当达到一定时间后，抗逆能力差的原生质体长时间暴露在酶液中，一些杂酶不断破坏原生质体膜，使得原生质体破碎，原生质体数量下降，活性也受到影响[25]。因此，确定好酶解时间是至关重要的。不同菌丝的细胞壁构成和厚薄不同，使用的酶不同，所需要的酶解时间也不同。王昱等[26]发现酶解2.5h时灵芝原生质体的数量最多。许谦[27]发现酶解3h时桑黄原生质体的数量最多。

1.7 不同pH对原生质体制备的影响

pH是影响酶活的重要因素，在不同的pH下，酶的活性大大不同。陈敏等[28]发现用溶壁酶酶解杏鲍菇菌丝，在酶液的pH 为4.5～5时效果最好。张李阳[29]发现溶壁酶酶液的pH为5.5时，灵芝原生质体的产量最高，但在pH 5.0～6.5范围内，再生率的变化不甚明显，建议采用缓冲液配制酶液。

1.8 不同预处理方式对原生质体制备的影响

有研究表明酶解前对菌丝进行适当的预处理，原生质体的产量明显不同。沙涛等利用2-硫基苏糖醇(DDT)、硫代乙醇酸钠和B-巯基乙醇等3种预处理液对松茸菌丝进行预处理，发现经2-硫基苏糖醇(DDT)处理过的菌丝的原生质体制备率明显高于其它两种预处理液处理过的菌丝以及未处理的菌丝[25]。

2 原生质体再生

2.1 不同培养方式对原生质体再生的影响

培养方式不同，原生质体再生率不同。周礼红等[30]通过对蛹虫草原生质体的制备与再生的研究，发现用双层平板法培养的原生质体再生率高。李刚等[20]通过对灵芝原生质体分离和再生的研究发现在双层平板法中，上层琼脂浓度越低，原生质体再生率越高；当上层琼脂浓度为0.2%，原生质体的再生效果最好(当上层琼脂浓度低于0.2%时，上层平板难以凝固，影响了再生菌落的计数)。

2.2 不同再生培养基对原生质体再生的影响

不同的菌种需要的养分不同，而不同的培养基所含有的养分也不同，所以选好再生培养基至关重要。周礼红等[30]用含有0.6mol/L蔗糖的PDA、沙氏、Vogel’s培养基作再生培养基培养蛹虫草原生质体，发现含有0.6mol/L蔗糖的PDA培养基的效果最好。祝子坪等[12]用含有0.6mol/L渗透压稳定剂的PDA再生培养基、PDA+桑枝再生培养基、麦芽糖酵母粉再生培养基、纤维二糖再生培养基培养桑黄原生质体，发现含有0.6mol/L渗透压稳定剂的PDA+桑枝再生培养基的效果最好。

2.3 不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响

原生质体分离和再生是两个完全不同的过程，分离原生质体是细胞壁的分解，而原生质体再生是破碎的细胞壁的重新生成，细胞结构和功能恢复，细胞正常分裂和生长的过程，而糖类和醇类作为再生培养基的渗透压稳定剂，既可以维持原生质体的形态，又可以作为营养因子，提供其再生物质的保证[8]。祝子坪，曹文芩等[12,18]发现甘露醇作为再生培养基的渗透压稳定剂再生率高；王昱, 周礼红等[26,30]发现蔗糖作为再生培养基的渗透压稳定剂时再生率高。祝子坪等[12]在试验中发现以氯化钙和硫酸镁为渗透压稳定剂时，培养基很难凝固，即使凝固后仍有较高的流动性，妨碍再生试验的进行。

3 结语与展望

食用菌产业是一项集经济效益、生态效益和社会效益于一体的短平快农村经济发展项目，食用菌又是一类有机、营养、保健的绿色食品。发展食用菌产业符合人们消费增长和农业可持续发展的需要，是农民快速致富的有效途径。如何获得生长周期短、营养丰富、口感良好、抗病能力强的食用菌菌种是科研工作者一直努力的方向。

近年来，大型真菌药剂的研制一直是新药开发的重要领域。自1985年实施《药品管理法》以来，经部、省批准的大型真菌单方或复方制剂有100多个品种，充分显示出大型真菌制剂在医药方面的光明前景[31]。

原生质体技术为上述问题的解决提供了研究思路。原生质体的制备和再生是原生质体技术的基础和前提。在原生质体制备和再生过程中可以引起菌种各种各样的变化，如菌落形态、菌丝生长速度、营养缺陷型或抗药性的回复突变、质粒的消失以及产量、质量等方面的变化。因此，原生质体形成和再生技术也可以作为菌种改良的一种手段[32]。原生质体融合和外缘DNA导入原生质体技术能够有效克服远缘杂交的障碍，大大加快了育种进程。逐步实现稀有大型真菌原生质体的制备与再生，能够更有效地保护、改良和利用野生种质资源。

原生质体制备和再生受多种条件影响，且不同菌种的制备和再生条件差异大，在原生质体的制备和再生中应综合考虑各种因素，寻求最佳条件。

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Research on Formation and Regeneration of Protoplast of Macrofungi

Li Jingying , Sun Tingting, Zhang Guoquan, Zou Li*

(Northeast Forestry University, Harbin 150040)

This paper summarized protoplast preparation and regeneration technology of various macrofungi and analysed factors influencing protoplast preparation and regeneration of macrofungi, which provides theory basis for the research on breeding and transgene of macrofungi in the future.

Macrofungi; Protoplast; Formation; Regeneration

2015-04-08

Q813.2

A

*通讯作者：邹莉(1966-)，女，教授，主要从事食药用菌的教学与研究，E-mail：13903650896@163.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.038