食肉动物细小病毒结构蛋白VP2的研究进展

林 鹏，王建科，赵 航，程世鹏

(中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林长春 130112)

食肉动物细小病毒主要包括犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)及猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)，属于细小病毒科、细小病毒属。这些病毒具有很高的亲缘关系，基因组核苷酸及蛋白质序列相似性高达98 %以上，并且呈全球性流行。细小病毒引起的疾病对我国犬科、猫科及鼬科等动物危害非常严重，并造成较大的经济损失。

目前，对细小病毒研究越来越深入，其中VP2 作为细小病毒主要的结构蛋白，对其结构和功能的了解更加全面：细小病毒的抗原位点主要分布于该蛋白中、该蛋白能够刺激机体产生中和抗体、决定宿主范围以及病毒与宿主之间相互作用，而且该蛋白与病毒的血凝特性有关[1]。本文主要从食肉动物细小病毒的生物学特性、VP2 蛋白功能、疫苗的研发情况及病原的检测方法等角度进行归纳总结，为防制疾病的传播和研制新型疫苗等方面提供参考。

1 食肉细小病毒的生物学特性

1.1 细小病毒的形态特点 食肉动物细小病毒隶属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)，病毒粒子为等轴对称二十面体，无囊膜，大小在18 nm～26 nm之间。

1.2 细小病毒基因组结构 食肉动物细小病毒基因组为单链DNA，其长度约为5 000 nt，基因组的3' 端和5' 端分别含有约为200 nt 和60 nt 反向重复序列，发夹结构与病毒DNA 的复制及其转录密切相关；其3' 末端的羟基为细小病毒基因组复制的引物，若磷酸化后，可以保护病毒的DNA 不被降解。由于细小病毒为无囊膜病毒，因此对外界具有较强的抵抗力，酒精、氯仿等有机溶剂具有抵抗性。病毒的基因组中含有两个主要的开放阅读框(ORF)，分别编码结构蛋白(VP1、VP2 及VP3)和非结构蛋白(NS1、NS2)，它们是通过可变剪接形成不同的翻译模板，并且有些细小病毒还存在其他小的ORF。VP1 参与病毒感染细胞和病毒衣壳蛋白组装，其N 端为结合病毒基因组的3'端，有助于稳定病毒基因和引导病毒的基因进入细胞核中；VP3 是由VP2 在蛋白酶作用下裂解产生的，并且只存在完整的病毒粒子中。

VP2 约占病毒粒子衣壳蛋白的90 %，作为病毒的主要蛋白与病毒的致病性、宿主的范围密切相关，并且具有良好的免疫原性，是刺激机体产生中和抗体的主要抗原表位。其中几个重要的氨基酸发生改变，能够导致病毒的致病性、抗原特性甚至宿主的范围均会发生改变。

1.3 血凝特性 细小病毒具有血凝的特性，能够引起恒河猴、猪、马、猫和仓鼠等红细胞凝集，这一特性可以作为鉴定该病毒的一个重要指标。血凝特性受pH 值的影响，VP2 第375 位氨基酸残基能够影响凝集红细胞时pH值大小，FPV 在该位点为Asp，而CPV 则为Asn，由于该位点的差异导致FPV 的红细胞凝集最低的pH 值为6.5，而CPV 与FPV 最高pH 值可以达到8.0；同时该位点也能调控与转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TfR)结合能力和影响宿主的范围。研究显示CPV 和FPV 能够识别非人类红细胞上的唾液酸羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)[2]，细小病毒科中许多病毒均依赖于宿主的唾液酸进行直接吸附或者感染[3]，如鼠细小病毒(Murine minute virus，MVM)能够直接结合Neu5Gc，而不同MVM病毒株的感染力和毒力是由与唾液酸结合能力的差异所导致的。犬和猫不同组织中均存在Neu5Gc，但缺少系统的研究。细小病毒凝集红细胞主要反映在红细胞上的Neu5Gc 的含量，而血凝效价与红细胞表面Neu5Gc 含量无关。

2 VP2结构蛋白的功能

2.1 VP2蛋白的结构 细小病毒mRNA 在启动子P38 控制下转录，翻译形成VP1，通过剪接后翻译形成VP2。CPV 衣壳蛋白主要由8 个反向平行的β-折叠桶和4 个镶嵌于p 折叠的大环组成；VP2 由无规则卷曲形式构成，分别为Loop1、Loop2、Loop3、Loop4 和Loop5。环的结构决定病毒的性质，如中和抗体的主要抗原表位是由环的结构决定，VP2N 端及其蛋白转角结构区是重要的B 细胞抗原表位区，这些区域氨基酸残基的变化会导致抗原漂移。

2.2 VP2蛋白基因的遗传进化 对CPV 和FPV 进化方式研究发现，普遍认为CPV 来自于FPV，FPV 是MEV 和CPV 的祖先[4]。在芬兰，从狐狸体内分离到蓝狐细小病毒，通过分析其vp2 基因序列发现介于FPV 和CPV-2 之间，FPV 感染水貂和狐狸等毛皮动物可能对FPV 向CPV-2 型转变起过渡作用。FPV 和MEV 的VP2 序列之间只存在4 个氨基酸残基的差异(第79、106、116 和335位)；FPV 与CPV 型之间也仅仅存在6 个氨基酸残基的差异(第80、89、103、323、564 和568 位)。通过系统发育树分析表明FPV 基因是通过随机遗传而改变，而CPV 是在有选择压力的情况下发生的。

CPV-2 型首次分离于1978 年，随后在1980 年后分离到新的病毒株，分析该病毒株为CPV-2 的亚型，命名为CPV-2a 型；随后又发现一个新的亚型CPV-2b 型；最近报道新的亚型为CPV-2c 型。从CPV-2 型经历CPV-2a 型、CPV-2b 型直到CPV-2c 型只在5 个位点氨基酸残基发生变化(第87、300、305、426 和559 位)。VP2 上少数氨基酸残基的改变，能够导致该蛋白空间构象改变，从而可能使病毒宿主的范围和致病性等发生显著地变化。CPV VP2中第87 位、第101 位和第305 位氨基酸残基位于抗原位点A 和B 上，若其改变能够导致蛋白构象发生改变，这与氨基酸侧链发生变化或者氢键的得失有关[5]；目前在中国大陆、中国台湾、日本、乌拉圭和韩国等地区分离的CPV-2a 型中大部分存在T324I 现象[6]。目前研究显示CPV-2 型感染宿主的范围在不断地变化，CPV 各个亚型能够引起临床症状与FPV 引起的症状非常相似，推测CPV 可能重新适应猫科动物，所以细小病毒的宿主范围扩大可能导致出现新的亚型；Ikeda 通过分析所分离FPV的VP2 氨基酸序列，显示第323 位氨基酸残基由FPV 特有的Asp 突变为CPV 的Asn，表明VP2 序列中的一个或者几个位点可以控制宿主的范围[7]。从发病猴子体内分离到一株FPV，序列分析显示第323 位和第564 位氨基酸均发生突变，很有可能由于这两个位点改变使FPV 具有感染猴子的能力[8]。

病毒进化一般通过3 种方式实现：疫苗选择压力、病毒在机体内发生重组和病毒在自然条件下发生变异。其中基因重组是细小病毒进化的一种重要的机制。研究显示基因重组常常存在于机体同时感染不同种类的细小病毒[9]。在犬体内能够同时感染CPV-2b 型与CPV-2c 型[10]、CPV-2a 型与CPV-2c 型，在猫体内也能同时感染CPV 和FPV[9]，目前已经证实在vp 基因上出现FPV 与CPV，FPV与CPV 基因重组[11-12]，并且CPV、MEV 和FPV 之间存在免疫学交叉反应。研究表明FPV 弱毒疫苗在免疫猫后能够抵抗CPV-2b 型感染[13]；合成CPV VP2 肽段免疫水貂后能免受MEV 的感染；经福尔马林灭活的FPV 免疫水貂后，能够保护水貂免受感染。CPV 亚型之间也可以进行保护，如CPV-2b 亚型疫苗免疫犬后能刺激机体产生CPV-2a 亚型和CPV-2c 亚型的抗体[14]，但也存在特有的抗原表位。

通过单核苷酸多态性分析显示，CPV vp2 基因序列中第1 276～1 278 位决定第426 位氨基酸残基，CPV-2a 型为Asn、CPV-2b 型为Asp、CPV-2c 型为Glu。通过复杂的动力选择表明，CPV VP2 第426 位氨基酸残基也不断发生改变，使得CPV 抗原性在不断地变化，因此VP2 氨基酸序列个别位点的突变可能改变致病性[15]。CPV-2c 型比CPV 其他型感染犬的临床症状和致死率都要高；如果反复接种疫苗，在病毒复制的过程中第426 位氨基酸残基突变为Glu 的几率就大的多[16]。目前CPV VP2 第300 位和第426 位氨基酸残基仍存在突变，可能CPV 仍处在变异及进化的过程。CPV VP2 中存在T440A，但该突变的功能还不清楚，有待于进一步的研究[17]。CPV VP2 中第267 位到498 位之间氨基酸残基能形成GH 环，位于βG 和βH之间，该段对细小病毒变异影响最大[17]。FPV 和CPV 在抗原性方面存在明显的差异，可能主要由于VP2 中第93位和第323 位氨基酸残基差异所导致的。

研究发现一只3 月龄的猫体内同时感染CPV-2a 和FPV，认为是FPV 和CPV 中间体的细小病毒变异体，该病毒同时含有CPV-2a 型和FPV 特异的表位。FPV 和CPV重组后，VP2 第80 位、564 位和568 位氨基酸残基对该重组病毒感染宿主的范围起到一定的重要作用。目前已经研究显示猫能够感染CPV 2a 型、2b 型和2c 型[18]。

2.3 转铁蛋白受体 细小病毒在感染的过程中，病毒表面的VP2 与宿主细胞膜表面上的TfR 相结合，通过依赖Dynamin 和Clathrin 介导的内吞现象运至内涵体，从而使病毒感染宿主细胞内。病毒被内吞后在细胞质运输是一个缓慢的过程。CPV 结合细胞表面的TfR 后，在细胞膜下聚集，质膜内陷形成小泡，包被CPV 粒子，进入早期胞内体；小泡与膜进行分离时需要动力蛋白的参与；该动力蛋白在CPV 和受体共同定向转移到细胞核中起重要作用。细胞质中的pH 值能够影响病毒的感染[17]，此外病毒在感染过程中也会受到环境温度和离子浓度等因素影响，可能导致病毒受体和病毒编码蛋白的空间构象以及化学键之间的相互作用发生改变，从而导致病毒感染力下降。CPV VP2 第299 位和300 位氨基酸残基影响与TfR 相结合，研究显示TfR 中L221S 或者L221D 的点突变能够抑制病毒的感染能力[19]；还有些报道TfR 部分缺失Tyr-Thr-Arg-Phe 会降低病毒进入细胞的能力。重组TfR 与CPV VP2 结合后，能够抑制CPV 感染机体细胞，从而降低了犬的死亡率。在CPV-2 型中VP2 发生G299E 突变时，完全失去了与犬细胞上TfR 的结合，从而失去感染犬细胞的能力[20]。

目前细小病毒的宿主存在特异的TfR，例如FPV 只能结合猫源的TfR，但CPV 不仅能结合猫源的TfR 还能结合犬源的TfR。TfR 的N 端第135～430 位之间氨基酸残基决定病毒对宿主细胞的嗜性，CPV-2 型与猫或水貂的细胞结合程度比CPV-2b 型强，主要是由于第87 位和101位的氨基酸残基，但第305 位氨基酸作用较小[5]。

某些细小病毒感染细胞是通过受体结合蛋白识别宿主的唾液酸受体，导致病毒直接吸附宿主细胞或者提高与细胞的结合能力。当FPV 和CPV 与TfR 结合时，唾液酸起重要作用，能增加细胞表面上Neu5Gc 的含量，而在体外则不能增加[2]，该机制也是细小病毒感染细胞的一种方式[21]。TfR 在恶性肿瘤细胞中含量较高，可能该受体与细胞增殖相关。

2.4 VP2在疫苗研究上的应用 由于VP2 具有较强的免疫原性，是产生中和抗体的主要病毒抗原，所以不仅传统疫苗(灭活疫苗、弱毒疫苗)利用此特性，而且新型疫苗(基因工程亚单位疫苗、DNA 疫苗、转基因植物疫苗、基因工程重组活载体疫苗、表位疫苗等)的研究也集中到VP2 上。目前疫苗接种是防制食肉动物细小病毒病的一项重要手段，但由于该病毒的持续不断地变异，可能导致出现免疫失败现象。

2.4.1 传统疫苗 吴威采用单克隆抗体(MAb)对我国MEV 进行系统分型，筛选出毒力稳定、免疫原性良好的病毒株，并且研制出MEV 灭活疫苗；通过CPV 在犬体内连续传代的方式研发出弱毒疫苗，此疫苗能够诱导机体产生抗CPV 的中和抗体；Wilson 等发现针对CPV-2b 型的疫苗免疫犬后，能够产生中和抗体，保护机体免受不同亚型CPV 病毒株的攻击，提供交叉保护[14]。

2.4.2 新型疫苗 食肉动物细小病毒VP2 是抗原决定蛋白，VP2 单独表达能够产生良好的免疫源性，可以刺激机体产生中和抗体，对动物机体无毒副作用。VP2 可以形成一个不含病毒核酸的病毒样颗粒(Virus like particle,VLPs)，在病毒形态上与原病毒相似。当VLPs 免疫小鼠后，刺激CD4+和CD8+T 淋巴细胞，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。VLPs 可以作为疫苗，防制疾病的发生，具有安全性高、免疫性强等优点。

利用含有vp2 基因表达重组质粒和杆状病毒表达系统表达VP2 免疫犬后均能够得到良好的免疫保护；CPV vp2基因与狂犬病病毒的糖蛋白基因共同连接到pIRES 载体上，可以表达2 种抗原蛋白的双顺反子DNA 疫苗[22]；将MEV vp2 基因构建转基因植物疫苗，能够对MEV 的强毒感染具有良好的免疫保护作用[23]；CPV VP2 抗原表位2L21 连接到霍乱毒素基因上并且在烟草的叶绿体中融合表达的重组蛋白，免疫小鼠能够产生高效价的抗2L21 的抗体，可以在体外中和CPV[24]；利用犬2 型腺病毒构建FPV VP2 重组腺病毒活载体疫苗，免疫后能够诱导机体产生抗体[25]。未来随着DNA 疫苗的发展，有可能也会应用到水貂病毒性肠炎的预防上；Zhang 等利用噬菌体展示技术筛选出与MEV 结合强的多肽，为研制高效、特异性强的疫苗奠定了基础[26]。

2.5 VP2在诊断方面的应用 目前细小病毒病的诊断方法有形态学鉴定诊断、血清学诊断、分子生物学诊断以及动物回归实验等。其中血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验、ELISA、中和试验和PCR 等多种实验技术都是利用VP2及其编码基因的特性进行细小病毒病的诊断。

以细小病毒vp2 基因为模板，建立的SYBR Green 染料法的实时定量PCR，能够同时检测CPV、FPV 和猪细小病毒，该方法具有良好的敏感性和特异性，最低检测量为10 拷贝/μL[27]；根据CPV vp2 基因采用隔热式恒温PCR 技术检测CPV，也具有很高的敏感性和特异性，分别为98.41 %和100 %，与实时定量荧光PCR 检测结果相当[28]；针对CPV vp2 基因采用环介导等温扩增技术(Loopmediated isothermal amplification，LAMP)分别与ELISA 和横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick，LFD)相结合检测CPV，具有更高的敏感性和特异性，与传统的PCR 和PCR-ELISA 相比最低检测量提高了100 倍[29]。Horiuchi 等在制备的MAb 具有交叉反应，并能够识别VP2 中第93位的Lys，该位点是FPV 和MEV 所特有的，可以用来鉴别FPV 和MEV 与其他病毒[4]；利用高分辨率熔解曲线(High-resolution melting，HRM)技术根据CPV-2 型vp2 基因进行快速诊断，PCR-HRM 能够通过不同的溶解温度的差异区分CPV-2a 型、CPV-2b 型和CPV-2c 型；该技术具有极高的敏感性、成本低廉，速度快等优点，可以实现真正意义上的闭管操作[30]。近年来胶体金免疫层析技术在兽医临床广泛应用，其技术操作简便快捷、成本低廉和直接显示结果等优点，使其在诊断领域等方面迅速的推广，但在食肉动物细小病毒诊断方面研究较少。

3 结语

食肉动物细小病毒在遗传进化过程中发生基因组的突变和重组等，病毒变异株不断产生，从而导致病毒的宿主范围可能不断地扩大，改变致病性等特性。分析显示细小病毒变异株具有各自的抗原特性，这就对疫苗的保护效力提出更高的要求。目前细小病毒在野生动物之间、野生动物与饲养食肉动物之间的传播尚未清楚，这为我们提供下一步的研究方向。

预防食肉动物细小病毒病的手段主要是接种疫苗，目前也出现一些问题，例如长期接种弱毒疫苗引起病毒血症、免疫失败引起疾病的发生等问题[18]。随着科技水平不断的提高，对食肉动物细小病毒进行了深入的研究，尤其对VP2 结构蛋白的认识不断的加深，将更好的了解细小病毒如何感染宿主细胞的工作机制，为细小病毒病的综合防制提供了坚实的理论基础，从而保证相关的养殖业更好地发展。

[1]Calderon M G,Wilda M,Boado L,et al.Study of canine parvovirus evolution:Comparative analysis of full-length VP2 gene sequences from Argentina and international field strains[J].Virus genes,2012,44(1):32-39.

[2]Lofling J,Michael L S,Parrish C R,et al.Canine and feline parvoviruses preferentially recognize the non-human cell surface sialic acid N-glycolylneuraminic acid[J].Virology,2013,440(1):89-96.

[3]Wu Zhi-jian,Miller E,Agbandje-McKenna M,et al.α2,3 and α2,6 N-linked sialic acids facilitateefficient binding and transduction by adeno-associated virus types 1 and 6[J].J Virol,2006,80(18):9093-9103.

[4]Horiuchi M,Mochizuki M,Ishiguro N,et al.Epitope mapping of a monoclonal antibody specific to feline panleukopenia virus and mink enteritis virus[J].J Vet Med Sci,1997,59(2):133-136.

[5]Stucker K M,Pagan I,Cifuente J O,et al.The role of evolutionary intermediates in the host adaptation of canine parvovirus[J].J Virol,2012,86(3):1514-1521.

[6]Lin Chao-nan,Chien Chi-hsien,Chiou Ming-tang,et al.Genetic characterization of type 2a canine parvoviruses from Taiwan reveals the emergence of an Ile324 mutation in VP2[J].J Virol,2014,11(1):39-42.

[7]Ikeda Y,Mochizuki M,Naito R,et al.Predominance of canine parvovirus(CPV)in unvaccinated cat populations and emergence of new antigenic types of CPVs in cats[J].Virology,2000,278(1):13-19.

[8]Yang Song-tao,Wang Shu-jun,Hao Feng,et al.Isolation and characterization of feline panleukopenia virus from a diarrheic monkey[J].Vet Microbiol,2010,143(2):155-159.

[9]Battilani M,Balboni A,Ustulin M,et al.Genetic complexity and multiple infections with more Parvovirus species in naturally infected cats[J].Vet Res,2011,42(1):43-49.

[10]Vieira M J,Silva E,Desario C,et al.Natural coinfection with 2 parvovirus variants in dog[J].Emerg Infect Dis,2008,14(4):678-682.

[11]Ohshima T,Mochizuki M.Evidence for recombination between feline panleukopenia virus andcanine parvovirus type 2[J].J Vet Med Sci,2009,71(4):403-408.

[12]Wang Jian-ke,Cheng Shi-peng,Li Yi,et al.Evidence for natural recombination between mink enteritis virus and canine parvovirus[J].Virol J,2012,9(1):252-259.

[13]Gamoh K,Senda M,Inoue Y,et al.Efficacy of an inactivated feline panleucopenia virus vaccine against a canine parvovirus isolated from a domestic cat[J].Vet Rec,2005,157(10):285-287.

[14]Wilson S,Illambas J,Siedek E,et al.Vaccination of dogs with canine parvovirus type 2b(CPV-2b)induces neutralising antibody responses to CPV-2a and CPV-2c[J].Vaccine,2014,32(42):5420-5424.

[15]Aldaz J,Garcia-Diaz J,Calleros L,et al.High local genetic diversity of canine parvovirus from Ecuador[J].Vet Microbiol,2013,166(1):214-219.

[16]Decaro N,Desario C,Elia G,et al.Evidence for immunisation failure in vaccinated adult dogs infected with canine parvovirus type 2c[J].New Microbiol,2008,31(1):125-130.

[17]Decaro N,Desario C,Parisi A,et al.Genetic analysis of canine parvovirus type 2c[J].Virology,2009,385(1):5-10.

[18]Decaro N,Crescenzo G,Desario C,et al.Long-term viremia and fecal shedding in pups after modified-live canine parvovirus vaccination[J].Vaccine,2014,32(30):3850-3853.

[19]Palermo L M,Hueffer K,Parrish C R.Residues in the apical domain of the feline and canine transferrin receptors control host-specific binding and cell infection of canine and feline parvoviruses[J].J Virol,2003,77(16):8915-8923.

[20]Strassheim M L,Gruenberg A,Veijalainen P,et al.Two dominant neutralizing antigenic determinants of canine parvovirus are found on the threefold spike of the virus capsid[J].Virology,1994,198(1):175-184.

[21]Clegg S R,Coyne K P,Parker J,et al.Molecular epidemiology and phylogeny reveal complex spatial dynamics in areas where canine parvovirus is endemic[J].J Virol,2011,85(15):7892-7899.

[22]Patial S,Chaturvedi V K,Rai A,et al.Virus neutralizing antibody response in mice and dogs with a bicistronicDNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein and canine parvovirus VP2[J].Vaccine,2007,25(20):4020-4028.

[23]Dalsgaard K,Uttenthal A,Jones T D,et al.Plant-derived vaccine protects target animals against a viral disease[J].Nat Biotechnol,1997,15(3):248-252.

[24]Molina A,Veramendi J,Hervas-Stubbs S.Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus[J].Virology,2005,342(2):266-275.

[25]Yang Song-tao,Xia Xian-zhu,Qiao Jun,et al.Complete protection of cats against feline panleukopenia viruschallenge by a recombinant canine adenovirus type 2 expressing VP2 from FPV[J].Vaccine,2008,26(11):1482-1487.

[26]Zhang Qing-ming,Wang Yu-ping,Ji Qun,et al.Selection of an-tiviral peptides against mink enteritis virus using a phage display Peptide library[J].Curr Microbiol,2013,66(4):379-384.

[27]Lin Chao-nan,Chien Chi-hsien,Chiou Ming-tang,et al.Development of SYBR green-based real-time PCR forthe detection of canine,feline and porcine parvoviruses[J].Taiwan Vet J,2014,40(01):1-9.

[28]Wilkes R P,Lee P Y A,Tsai Y L,et al.An Insulated isothermal PCR method on a fielddeployable device for rapid and sensitive detection of canine parvovirus type 2 at points of need[J].J Virol Methods,2015,225:35-38.

[29]Sun Yu-ling,Yen Chon-ho,Tu Ching-fu.Visual detection of canine parvovirus based on loop-mediated isothermal amplification combined with enzyme-linked immunosorbent assay and with lateral flow dipstick[J].J Vet Med Sci,2014,76(4):509-516.

[30]Bingga G,Liu Zhi-cheng,Zhang Jian-feng,et al.High resolution melting curve analysis as a new tool for rapid identification of canine parvovirus type 2 strains[J].Mol Cell Probe,2014,28(5):271-278.