3种不同剂量的青蒿琥酯抗小鼠细粒棘球蚴疾病作用的比较

张宏伟，彭心宇，吴向未，杨宏强，吕海龙，张示杰

3种不同剂量的青蒿琥酯抗小鼠细粒棘球蚴疾病作用的比较

张宏伟，彭心宇，吴向未，杨宏强，吕海龙，张示杰

目的 探讨高、中、低3种不同剂量青蒿琥酯体内抗包虫的作用。方法 建立小鼠腹腔细粒棘球蚴疾病模型，随机分为4组，每天分别给与高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3种剂量的青蒿琥酯注射液以及生理盐水，腹腔注射治疗3月后，观察小鼠体内包虫囊肿的外观发育情况、囊湿重、包虫囊壁的病理改变、电镜下超微结构的变化。结果 中剂量组小鼠总囊重明显少于其他各组。中等剂量组抑囊率高于其他各组。病理及电镜发现3种剂量下包虫囊壁均有不同程度的破坏，其中中等剂量组囊肿中到重度破坏，角皮层纹理模糊，生发层细胞减少，甚至断裂，细胞核及线粒体溶解或退变。结论 在相同的饲养条件下，中等剂量的青蒿琥酯注射液治疗小鼠腹腔细粒棘球蚴疾病的效果最佳。

细粒棘球蚴;青蒿琥酯;剂量;治疗作用

细粒棘球蚴病是威胁人类健康的全球性的寄生虫病，目前的治疗方法以手术治疗为主，药物治疗为辅。对于失去手术指征的患者，药物治疗是唯一的选择，因此关于药物治疗包虫病的研究一直备受关注。抗疟疾的一线药物青蒿琥酯，作为免疫调节剂，在防治寄生虫方面的研究逐渐成为热点，但其用量与免疫效果之间关系仍存在争议。本研究通过建立小鼠腹腔细粒棘球蚴模型，取高、中、低3种剂量的青蒿琥酯注射液治疗3月，观察其抗包虫治疗效果，从而寻求最佳治疗剂量。

1 材料与方法

1.1 实验动物以及药品准备 雌性昆明小鼠60只，体重(20±5) g，由石河子大学实验动物研究中心提供。青蒿琥酯注射液桂林南药股份有限公司提供，生产批号ZA080103，使用时溶解于5%碳酸氢钠溶液，并用生理盐水稀释到所需的浓度。

1.2 动物模型的建立 从自然感染的绵羊肝细粒棘球蚴囊中无菌抽取囊液，自然沉淀后去上清，收集原头节，反复用生理盐水冲洗，1 000 r/min离心数次，去上清液，伊红染色，镜下活检计算其活性率为80%以上 ，将原头节稀释到1 500个/mL，加入使每毫升均含青霉素和链霉素各500 U，每只小鼠注射1 mL稀释液约1 500个原头节。采取多点注射，保证接种均一性。

1.3 给药方法 将包虫模型小鼠随机分为4组，高剂量组、中剂量组、低剂量组和模型对照组，每组15只，每天分别腹腔注射1次青蒿琥酯注射液200 mg/kg，100 mg/kg，50 mg/kg和等剂量的生理盐水，接种后第2 d开始，连续治疗3个月，解剖测量。

1.4 疗效评价

1.4.1 体外直接杀灭作用观察 取20%的盐水作对照，选取10 min，20 min，30 min时间点，5%伊红染色，光镜下观察青蒿琥酯注射液的混匀处理的原头节的存活情况，判断是否能用于术中灭活原头节。

1.4.2 细粒棘球蚴囊的大体观察 肉眼观察细粒棘球蚴囊发育的外观形态。

1.4.3 细粒棘球蚴囊湿重 停药后第2 d，摘取腹腔全部囊称重，计算抑制率。

抑制率=(C-T)/C×100%(C：对照组囊湿重均值；T：治疗组囊湿重均值)

1.4.4 病理组织学观察 取细粒棘球蚴囊肿，用10%的中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，HE染色、切片，按照细粒棘球蚴囊生发层病理损伤程度分为3级，一级(正常)：生发层细胞核及胞质结构清晰完整，角质层纹理清晰；二级(变性)：生发层或角质层空泡样或颗粒样变性，基质溶解；三级(坏死)生发层细胞核固缩、溶解、消失，角质层崩解或嗜酸性坏死。

1.4.5 透射电镜观察 部分棘球蚴囊置4%戊二醛前固定，四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，EPDN.812包埋，超薄切片，置铜网上经醋酸铀、柠檬酸铝双重染色后，透射电镜观察。

1.5 统计学分析 运用SPSS13.0对实验数据进行方差分析。

2 结 果

2.1 体外直接杀灭头节效果 青蒿琥酯注射液处理头节，10～30 min内观察，在原头蚴周围出现环形隔离带，将原头节与外界溶液隔离，头节染色效果不明显，内部结构可见，头节存活(图1)。20%浓盐水在10 min时，0.5%伊红染色，高倍镜下观察原头节完全红染，糖原颗粒消失，内部结构无法辨认，头节死亡(图2)。

Endo-staining is not satisfactory; inner structure can be identified; the protoscoleces are alive(200×).

图1 青蒿琥酯处理头节30 min镜下观察

Fig.1 Changes of protoscoleces mixed with Art for 30 min, space to isolate the protoscoleces can be observed

Inner structure can not be identified; the protoscoleces are dead.(200×)

图2 20%浓盐水处理头节10 min观察

Fig.2 Changes of protoscoleces mixed with 20% saline for 10 min, the protoscoleces are fully stained

2.2 外观形态肉眼观察 各实验组囊肿主要分布在胃小弯、肝表面以及游离于腹腔，其中对照组以及高剂量组囊肿体积较大，表面光滑透明，张力较高；中剂量组囊肿体积较小，表面浑浊，张力较小；低剂量组囊肿透亮度差，张力较高。

2.3 各组囊湿重 高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低(50 mg/kg)3种剂量的青蒿琥酯注射液以及生理盐水，腹腔注射治疗3月后，电子天平计算囊湿重分别为：(0.038 8±0.004 59)g，(0.014 1±0.003 24)g，(0.021 5±0.004 87)g, (0.044 4±0.006 27)g。抑囊率分别为：12.6%，68.2%，51.5%(表1)。

表1 3种剂量青蒿琥酯治疗3月后，小鼠体内棘球蚴囊肿湿重及抑囊率

Tab.1 Comparison of hydatid cyst wet weight and inhibition rate between control and treated groups in mice

Note: Compared with control,P<0.01,F=11.2.

2.3 组织学观察 取大体组织，制作HE染色，病理切片，镜下观察发现：模型对照组囊肿角皮层呈多层纹理状，生发层单层细胞结构完整清晰。中等剂量组囊肿，角皮层模糊，生发层细胞数目明显减少，结构模糊，中-重度破坏(图3)。低剂量组和高剂量组囊肿轻-中度破坏(表2)。

Cells’ number of the germinal layer was significantly decreased.(200×)

图3 中剂量组治疗3月后

Fig.3 After treatment with Art for 3 months, the corneous layer of the cysts is vagued

表2 小鼠细粒棘球蚴囊肿病理改变比较

Tab.2 Comparison of pathologic changes of hydatid cyst in mice

Note: Group comparison,χ2=28.570,P<0.01.

2.4 细粒棘球蚴囊肿超微结构的观察 与模型对照组相比，中等剂量组组织结构破坏最为严重，表现为纤维囊壁内组织炎性细胞、嗜酸性细胞浸润，细胞分裂增殖，生发层细胞核模糊，甚至消失，线粒体退变，微毛蜕变(图4)。低剂量与高剂量组，组织结构均有不同程度的破坏。

Nucleus of the corneous layer disappeared and organelle damaged (6 000×).

图4 中等剂量组治疗3月后

Fig.4 After treatment with Art for 3 months

3 讨 论

青蒿琥酯(Artesunate,Art)是半倍萜内酯化合物青蒿素的衍生物 ,化学名为二青青蒿素-1 ,2-琥珀酸单酯,分子式为 C19O8H28,分子量384.43。2006年青蒿琥酯类药物被世界卫生组织定为疟疾重症抢救的首选药物,它除了有效抗疟疾作用外，尚有抗其他寄生虫如血吸虫[1]、肺孢子虫[2]、弓形虫[3]、棘球蚴[4-5]的作用，以及抗肿瘤、免疫调节等作用。在治疗棘球蚴方面，蒲秀英等[4]研究发现给与小鼠每天50 mg/kg剂量的青蒿琥酯治疗腹腔继发性棘球蚴病的效果优于每天25 mg/kg剂量的效果，而有其他研究发现，青蒿琥酯作为免疫调节剂，较大剂量(小鼠每天200 mg/kg)有免疫抑制作用，小剂量(小鼠每天100 mg/kg)有免疫增强作用[6]。本实验设计高、中、低3种剂量治疗小鼠继发性细粒棘球蚴疾病，观察青蒿琥酯抗包虫效果，寻求最佳治疗剂量。

为证实青蒿琥酯能否用于术中灭活头节，本研究另外设计了灭活实验。体外灭活实验研究发现，在原头蚴的周围出现明显的隔离带，可能的原因是青蒿琥酯微溶于水，易溶于碳酸氢钠溶液，故将带有青蒿琥酯的原头蚴进行伊红染色时，水溶液被排斥而形成隔离带，原头蚴着色不明显，在30 min内不能将其快速杀死，因此，不能用于术中灭活头节。但是Martin Spicher[5]体外培养，观察青蒿琥酯的抑制头节作用发现，在40 μmol/L第6 d的时表现出强烈的抑制作用。

体内实验研究发现，中剂量组治疗下抑囊率为68.2%，明显高于高(12.6%)、低剂量组(51.5%)，并且病理切片以及电镜研究表明，中等剂量组囊肿破坏最严重，表现在生发层细胞数目减少，细胞核模糊甚至消失，说明青蒿琥酯具有良好的抗棘球蚴的作用，与蒲秀英和Martin Spicher的研究一致，但所使用剂量不同。青蒿琥酯抗其他寄生虫作用主要表现在破坏其膜系统，如虫体的细胞膜、线粒体以及核膜[6-7]，并且在细胞免疫和体液免疫均发挥了重要的作用。作为免疫调节剂，在合适的剂量下，青蒿琥酯可提高小鼠机体免疫功能，可抑制棘球蚴引起的超敏反应，病理切片观察，青蒿琥酯治疗后的包虫囊肿生发层细胞数目明显减少，结构模糊，而中等剂量组的囊肿破坏最为严重。本实验电镜观察包虫囊肿生发层细胞发生核溶解，线粒体退变，据此可推断青蒿琥酯抗包虫病作用的机制可能为破坏其膜系统，减少其能量供给，阻止细胞核内DNA的复制和逆转录，从而抑制包虫的生长和繁殖。青蒿琥酯的免疫调节作用，与剂量有很大关系[8-9]，青蒿琥酯的作用机制目前研究发现可能与 Art阻止外钙内流有关通过影响细胞信号转导，从而影响生发层细胞摄取营养的作用，从而抑制包虫囊肿的生长[10]。除此之外，青蒿琥酯具有抗纤维化的作用[11]，包虫囊肿的外囊的形成是棘球蚴在不断的膨胀生长过程中，包绕在周围的肉芽肿性组织不断纤维化的结果，最终形成排列紊乱、致密的纤维组织[12]。在包虫囊肿的形成过程中伴有纤维化的发生，而青蒿琥酯能够抑制纤维化，因此包虫不能形成完整的囊壁，未能对棘球蚴形成良好的保护，在机体的免疫攻击下，从而使包虫生长受到抑制。本实验研究发现中等剂量组的治疗明显好于高剂量组和低剂量组，对于小鼠来说，用中等剂量治疗，能够更好的提高机体免疫力，发挥更好的免疫促进作用和抗包虫作用。

[1]Zhang YP, Huang YX, Sun MY, et al. An introduction on artesunate-a new type schistosmiasis prophylactic[J]. J Pract Parasitic Dis, 2002, 10(1):44-45. DOI:10.3969/j.issn.1672-2116.2002.01.021 (in Chinese) 张燕萍, 黄轶新, 孙明玉,等. 血吸虫病新型预防药青蒿琥酯[J].实用寄生虫病杂志, 2002, 10(1):44-45. DOI:10.3969/j.issn.1672-2116.2002.01.021

[2]Ye B, Chen YT, Liu CW. The effects of three artemisinin derivates on genes ofPneumocystiscarinii[J]. Chin J Zoonoses, 2002, 18(1):26-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2002.01.007 (in Chinese) 叶彬, 陈雅棠, 刘成伟. 青蒿素衍生物对卡氏肺孢子虫基因的影响[J]. 中国人兽共患病学报, 2002, 18(1):26-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2002.01.007

[3]Sarciron ME, Saccharin C, Petavy A. Effects of artesunate, dihydroartemisinin, and ailartesunate-dihydroartemisinin combination againstToxoplasmagondii[J]. Am J Trop Med Hyg, 2000, 62(1):73-76.

[4]Pu XY, Fu XY, Wang Q. Observation on the efficacy of artesunate against murine echinococcosis[J]. Chin J Parasitic Dis, 2005, 18(05):336-338. DOI:10.3969/j.issn.1673-5234.2005.05.005 (in Chinese) 蒲秀英，傅宣英，王琪. 青蒿琥酯治疗小鼠继发性棘球蚴病的效果观察[J]. 中国寄生虫病防治杂志, 2005, 18(05):336-338. DOI:10.3969/j.issn.1673-5234.2005.05.005

[5]Spicher M, Roethlisberger C, Lany C, et al.Invitroandinvivotreatments of echinococcus protoscoleces and metacestodes with artemisinin and artemisinin derivatives[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(9):3447-3450. DOI:10.1128/AAC.00553-08

[6]Wang CE, Xu ZT, Cao JT, et al. Ultrastructure study of effects of artesunate onToxoplasmain Hela cell[J]. J Chin Electr Microscopy Soc, 2002, 21(5):515-516. DOI:10.3969/j.issn.1000-6281.2002.05.025 (in Chinese) 王翠娥，徐在海，曹军田, 等. 青蒿琥酯对弓形虫滋养体超微结构的影响[J]. 电子显微学报, 2002, 21(05):515-516. DOI:10.3969/j.issn.1000-6281.2002.05.025

[7]Ni XY, Chen YT, Wang J, et al. Study on the anti-Pneunocystiscariniieffect of arteminsin derivativesinvitrowith transmission electron microscopic[J]. J Chin Antibiotics, 2002, 27(11):691-694. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.11.015 (in Chinese) 倪小毅，陈雅棠，王健, 等. 青蒿素衍生物体外抗卡氏肺孢子虫不同时相透射电镜观察[J]. 中国抗生素杂志, 2002, 27(11):691-694. DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2002.11.015

[8]Chen H, Maibach HI. Topical application of artesunate on guinea pigallergic contact dermatitis[J]. Contact Dermatitis, 1994, 30(5):280-282.

[9]Zhang RZ, Gao YX. Effects of artesunate on the function of phagocytes in mice[J]. Chin J Dermatovenereol, 1999, 13(4):205-206. (in Chinese) 张汝之, 高玉祥. 青蒿琥酯对小鼠吞噬细胞功能的影响[J]. 中国皮肤病杂志, 1999, 13(4):205-206.

[10]Luo L, Diane M, Loilliam BG. Blockade of Calcium-dependent chloride current in Xenopus Oocytes by chloride channel blockers and antimalarial drugs[J]. Cell Physiol Biochem, 1991, 1(5-6):251-254.

[11]Yang YF. Pharmacological action and clinical application of artemisinin and the derivatives[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2003, 12(4):253-254. (in Chinese) 杨耀芳. 青蒿素及衍生物的药理作用和临床应用[J]. 中国临床药学杂志, 2003, 12(4):253-254

[12]Wu XW, Peng XY, Zhang SJ, et al. Formation mechanisms of the fibrous capsule around hepatic and splenic hydatid cyst[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2004, 22(01):1-4. DOI:10.3969/j.issn.1000-7423.2004.01.001 (in Chinese) 吴向未, 彭心宇, 张示杰, 等. 肝脾棘球蚴囊周围纤维性囊壁形成机制的差异及临床意义[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2004, 22(1):1-4. DOI:10.3969/j.issn.1000-7423.2004.01.001

Effects of three dosage of artesunate on anti-echinococcosis in mice

ZHANG Hong-wei,PENG Xin-yu,WU Xiang-wei,YANG Hong-qiang,LYU Hai-long,ZHANG Shi-jie

(TheFirstAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

To explore the therapeutic effects of high, medium and low dosage of artesunate on anti-echinococcosis of mouse, abdominal mouse model were separated into 4 treatment groups of 10 animals each. Drug suspensions were prepared in 0.5% carboxymethylcellulose (CMC) and applied as follows: 200 mg/kg/d, 100 mg/kg/d, 50 mg/kg/d and 0.9% Sodium Chloride (control group). Treatment began at the next day of inoculation. Three months later, mice were sacrificed and parasite tissue removed from the peritoneal cavity, and the parasite appearance, weight, pathologic and ultra structure changes was determined. Parasite weight was as follows: within the control--(0.044 4±0.006 27 g); 200 mg/kg/d group--(0.038 8±0.004 59 g); 100 mg/kg/d group--(0.014 1±0.003 24 g); 50 mg/kg/d group--(0.021 5±0.004 87 g). The inhibition ratio was 12.6%, 68.2%, and 51.5% respectively. All groups had pathologic and ultra structure changes. Of the total, mice in the medium dosage groups were severely damaged, which manifested as corneous layer vagued. Amount of cells in germinal layer decreased significantly. The nucleus vagued and even disappeared and mitochondria showed cataplasis, which suggested that the treatment with 100 mg/kg/d has the best effect on mouse echinococcosis.

echinococcosis; artesunate; different dosage; therapeutic effect

Zhang Shi-jie, Email: zsj-sh@tom.com

国家自然科学基金资助项目(No.81160199 )

张示杰，Email:zsj-sh@tom.com

石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，石河子 832002

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.009

R383.3

A

1002-2694(2015)01-0041-04

2014-04-24；

2014-10-18

Funded by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160199)