间日疟原虫抗药性研究进展

徐 馨，刘怀鄂，刘永华，杨照青

间日疟原虫抗药性研究进展

徐 馨1，刘怀鄂1，刘永华2，杨照青1

疟疾作为一种致死性很高的全球性寄生虫病，一直被全世界所关注，疟疾的控制也被列入全球三大公共卫生问题之一。由于疟疾抗药性的流行和蔓延，尤其是间日疟抗性的快速传播，使得疟原虫抗性的检测、预测以及新药的研发成为当前研究重点。针对这一系列问题，本文对当前间日疟抗药性检测方法、分子机理以及热点抗间日疟药物做一综述。

间日疟原虫；抗药性；研究进展

疟疾是一种严重威胁人类健康的传染病，每年有 3亿 至 5亿新发疟疾病例和至少100万人因感染疟疾死亡。同时由于疟原虫抗药性的产生和迅速扩散，致使全球疟疾发病率和死亡率迅速回升，使全球疟疾防治面临严重困难，也严重威胁到我国人民身体健康和社会经济发展。由于恶性疟原虫感染引起的症状比其它种类的疟原虫严重以及间日疟原虫体外培养体系的缺乏等原因，69%的疟疾相关研究主要放在恶性疟疾方面。长期以来，间日疟原虫引起的疟疾被认为预后是良性的，对于间日疟原虫的研究并没有引起学术界的关注。但作为4种疟原虫中最流行的种类之一，间日疟原虫(Plasmodiumvivax)的分布比恶性疟原虫更广[1]，并且通过近期的研究发现间日疟同样是严重危及生命的重要寄生虫病。由间日疟原虫引起的疟疾给人类的健康、财富、繁荣带来巨大压力。然而，新药的研发速度远远落后于疟原虫抗药性的产生速度。因此间日疟原虫的抗药性研究自然成为抗疟治疗中的重要环节。

1 间日疟原虫抗药性检测方法

1.1 体内测定 体内测定法按服药后疟原虫清除的情况判断，据观察时间不同分1周法和4周法。按照世界卫生组织的分级标准[2]，抗性可分为3个等级。一级抗性(R1)定义为服药后7 d内疟原虫无性体被清除，但在 28 d内疟原虫无性体又重新出现者。二级抗性(RII)为服药后 48 h疟原虫无性体比服药前减少 75%以上，但 7 d内疟原虫无性体不转阴者。三级抗性(RIII)为服药后48 h疟原虫无性体没有减少到服药前的 75%，或原虫无性体数增加，随后亦未见无性体原虫转阴者。

1.2 体外测定

1.2.1 微量测定法 WHO 推荐的Rieckmann体外微量测试法基于计数可发育为裂殖体的原虫数目[3]。取0.2 mL 含虫血样，稀释于1.8 mL培养基中，在测定板各井中依次加入50 μL含虫血培养及混合液，在37 ℃恒温箱内蜡烛刚培养，培养19～37.5 h。培养时，疟原虫密度超过80 000个/μL血时，用健康人“O”型血红细胞稀释至20 000～50 000个/μL血。再按上述方法操作，计数厚血膜中20个无性体原虫范围内3个核及以上的裂殖体数。同位素微量测试法基于检测外源性核酸前体，同位素标记的次黄嘌呤掺入量。此外还有疟原虫乳酸脱氢酶分析，疟原虫乳酸脱氢酶及富组氨酸蛋白酶联免疫反应等色度检测方法[4-5]，以及近来发展的利用 SYBR Green Ⅰ等标记的荧光法和流式细胞仪法。最近，有文章表明，间日疟的检测ex-vivo 抗药性测定，如果不事先过滤除去白细胞，由于本底干扰较大，Rieckmann体外微量测试法成功率高于SYBR GreenⅠ[6]。

1.2.2 分子测定 分子生物学技术的发展为确定疟原虫抗药性的遗传学基础提供了新的研究工具。分子标记作为一项重要的补充工具，并不是体内抗药性检测的替代品，它适用于大规模筛查、评估及监测疟原虫抗药性。目前广泛应用于疟原虫抗药性研究的分子标记为单核苷酸多态性 (SNP)，这是Lander E 于 1996 年提出的第3代 DNA 遗传标记。DNA 芯片技术的日趋成熟使得 SNP 成为最重要最有效的分子标记。常用的实验室技术还包括 PCR 扩增测序[7]、限制性片段长度多态性分析(RFLP)[8]等。但由于我们对间日疟原虫的抗药性的机理知之甚少，目前明确的有针对性的抗药性靶标依然很少，需要我们加大研究力度。

2 间日疟原虫抗药性的分子机理

目前，对于间日疟原虫抗性的研究远远滞后落后于恶性疟原虫的抗性研究。在间日疟原虫的抗药性关联基因研究中，目前Pvdhfr和Pvdhps的点突变相似于恶性疟原虫的，与叶酸类药物抗性相关的研究报道较为肯定[9-10]。Pvmdr1的拷贝数的增加与甲氟喹的抗性有关系[10]，这与恶性疟原虫的也极为相似。而氯喹的抗药性却一直不清楚。可以肯定的是，与恶性疟原虫不同的是，与Pvcrt-o的点突变没有[9, 11-12]，可能与表达过量有关[10]，有研究认为与Pvmdr1的拷贝数的增加有关系[13]，但是更多的研究认为没有关系，拷贝数增加只与甲氟喹的抗性有关系[11]。也有认为与Pvmdr1的 Y976F和 F1076L位点的点突变有关系[10]，但是却没有进一步得到其他研究的支持[11-12]。

3 针对间日疟原虫抗药性的药物研究

抗疟药物在人类与疟原虫几千年的抗争中发挥了极为重要的作用，但由于疟原虫抗药性的迅速蔓延，多重耐药虫株的出现使得在很多疟疾重灾区,可供选择的抗疟药物已十分有限，急需新药的诞生。由于作为分布最为广泛的间日疟本身具有传播快、易复发、难于治愈的特点，对新药的研发提出了更高要求。在世界上大部分地区，由于恶性疟原虫对多种抗疟疾药物的广泛抗性产生，青蒿素类药物被确定为治疗恶性疟的一线药物。为了保护青蒿素类药物的敏感性，WHO推荐间日疟的治疗以氯喹-伯胺喹联合为一线药物。近70年来，氯喹-伯胺喹配伍依然是世界上大部分地区治疗间日疟疾的一线药物。

氯喹(Chloroquine)作为最早发现和使用的最为有效的抗疟药物，挽救了大量人类疟疾患者的生命和物质财富。但在大规模用于疟疾治疗后，疟原虫陆续对它产生抗药性，并且抗性虫株在全球范围迅速播散。针对氯喹耐药性的出现，新研发的WHO推荐用药还包括氨酚喹(Amodiaquine)、甲氟喹(Mefloquine)。目前研究较热的上市药物复方磷酸萘酚喹片(Arco)，在相关实验中证实一次服药可以拥有更长的有效血药浓度控制时间和较少的副作用。自从 1989年在巴布亚新几内亚地区发现首列氯喹抗性株以来[14]，多个地区相继发现抗性株[10,15]。在一些氯喹高抗性地区，比如索罗门群岛、瓦努阿图、巴布亚新几内亚、印度尼西亚等地区，由于敏感性降低的虫株量超过30%， ACT(Artemisinin-based Combination Therapy，ACT)方案已经取代氯喹治疗方案[15]。

青蒿素(Artemisinin)及其衍生物是一种具有与含氮杂环的奎宁衍生物完全不同的分子结构的含氧基团的新型倍半萜内酯类化合物。在疟疾治疗的相关实验证实青蒿素类药物比起奎宁类化合物具有高效、低毒的特点。自从1989年首次公开报道关于间日疟原虫对氯喹产生抗性以来学术界陆续开始研发除含氮杂环类化合物的新药物。目前WHO推荐的主要药物除青蒿素外还包括蒿甲醚(Artemether)、青蒿琥酯(Artesunate)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin)、蒿乙醚(Artemotil)。青蒿素类药物虽然未有耐药性报道，但是恶性疟原虫的体外试验显示敏感性在逐渐降低，对于易发生耐药的间日疟产生抗性问题更不容忽视。由于可供选择的抗疟药物种类有限，加之临床治疗过程中的不规范使用，加速了虫株抗性的产生，缩短了药物的有效期，加剧了新药研发迫切性。

伯氨喹是目前WHO推荐治疗方案中防止间日疟复发的唯一用药。由于氯喹和青蒿素类药物只能作用于红细胞内期，而只有伯胺喹可以杀灭红细胞外期，所以为了间日疟防治复发，前者与后者联用，才能取得好的效果。但是，人们除了发现间日疟原虫的氯喹抗性外[16-19]，还发现伯氨喹的抗性，巴西已发现24.5%的病例用伯氨喹防止复发失败[20]。可喜的是，目前他非诺喹(Tafenoquine)已经进入临床3期研究，取得好的效果，人们多了一些选择。在这项考证他非诺喹有效性和安全性的多中心双盲临床药物试验中发现，300 mg(89.2%)和600 mg(91.9%)的单次剂量他非诺喹联合氯喹治疗间日疟对间日疟复发率的控制效果明显好于单用氯喹(37.5%)和氯喹联合伯氨喹组(77.3%)，而副作用未见增加[15]。这些报告无不敦促人们寻找新的有效治疗途径。联合用药便是途径之一，联合用药因为不同药物作用的靶标不同，因此效果优于单独使用，则可以提高治疗效果或者延缓疟原虫产生抗性。

目前虽然已经拥有了疗效比较明确的包括ACT、氯喹联合伯氨喹在内的多种抗疟方案，但由于疟原虫抗药性的迅速蔓延,特别是多重抗药性疟疾的不断扩散,使得我们在很多疟疾重灾区的抗疟治疗捉襟见肘，可用药物日渐匮乏。如何能够简单准确的检出、预测疟原虫的抗性，快速研发有出效的药物是保证全球抗疟策略成功的关键。尤其对于分布面积最为广泛的间日疟，由于过去认识的偏差和体外培养条件的限制，相关的研究还处于初期阶段，还有很多工作需要继续探索与努力。

[1]Guerra CA, Howes RE, Patil AP, et al. The international limits and population at risk ofPlasmodiumvivaxtransmission in 2009[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2010, 4(8): 1935-2735. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000774

[2]Wongsrichanalai C, Pickard AL, Wernsdorfer WH, et al. Epidemiology of drug-resistant malaria[J]. Lancet Infect Dis, 2002, 2(4): 209-218. DOI: 10.1016/S1473-3099(02)00239-6

[3]Rieckmann K, Campbell G, Sax L, et al. Drug sensitivity ofPlasmodiumfalciparum: an in-vitro microtechnique[J]. Lancet, 1978, 311(8054): 22-23. DOI: 10.1016/S0140-6736(78)90365-3

[4]Woyessa A, Deressa W, Ali A, et al. Evaluation of CareStart malariaPf/Pvcombo test forPlasmodiumfalciparumandPlasmodiumvivaxmalaria diagnosis in Butajira area, south-central Ethiopia[J]. Malar J, 2013, 12: 218. DOI: 10.1016/j.actatropica.2009.05.014

[5]Sousa LP, Mariuba LA, Holanda RJ, et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection ofPlasmodiumvivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments[J]. BMC Infect Dis, 2014, 14(1): 49. DOI:10.1186/1471-2334-14-49

[6]Muhamad P, Chacharoenkul W, Rungsihirunrat K, et al. Assessment of in vitro sensitivity ofPlasmodiumvivaxfresh isolates[J]. Asian Pacif J Trop Biomed, 2011, 1(1): 49-53. DOI: 10.1016/S2221-1691(11)60067-1

[7]Khattak AA, Venkatesan M, Khatoon L, et al. Prevalence and patterns of antifolate and chloroquine drug resistance markers inPlasmodiumvivaxacross Pakistan[J]. Malaria J, 2013, 12(1): 310. DOI:10.1186/1475-2875-12-310

[8]Manandhar S, Bhusal CL, Ghimire U, et al. A study on relapse/re-infection rate ofPlasmodiumvivaxmalaria and identification of the predominant genotypes of P. vivax in two endemic districts of Nepal[J]. Malaria J, 2013, 12(1): 324. DOI:10.1186/1475-2875-12-324

[9]Dharia NV, Bright AT, Westenberger SJ, et al. Whole-genome sequencing and microarray analysis of ex vivoPlasmodiumvivaxreveal selective pressure on putative drug resistance genes[J]. Proc Nat Acad Sci U S A, 2010, 107(46): 20045-20050. DOI: 10.1073/pnas.1003776107

[10]Price RN, Auburn S, Marfurt J, et al. Phenotypic and genotypic characterisaton of drug-resistantPlasmodiumvivax[J]. Trends Parasitol, 2012, 28(11): 522-529. DOI: 10.1016/j.pt.2012.08.005

[11]Ganguly S, Saha P, Guha SK, et al. In vivo therapeutic efficacy of chloroquine alone or in combination with primaquine against vivax malaria in Kolkata, West Bengal, India, and polymorphism in pvmdr1 and pvcrt-o genes[J]. Antimicrobial Agents Chemother, 2013, 57(3): 1246-1251. DOI: 10.1128/AAC.02050-12

[12]Marques MM, Costa MRF, Santana Filho FS, et al.Plasmodiumvivaxchloroquine resistance and anemia in the Western Brazilian Amazon[J]. Antimicrobial Agents Chemother, 2014, 58(1): 342-347. DOI: 10.1128/AAC.02279-12

[13]Suwanarusk R, Chavchich M, Russell B, et al. Amplification of pvmdr1 associated with multidrug-resistantPlasmodiumvivax[J]. J Infect Dis, 2008, 198(10): 1558-1564. DOI: 10.1086/592451

[14]Rieckmann KH, Davis DR, Hutton DC.Plasmodiumvivaxresistance to chloroquine[J]. Lancet, 1989, 2(8673): 1183-1184. DOI: 10.1016/S0140-6736(89)91792-3[15]Bassat Q. The use of artemether-lumefantrine for the treatment of uncomplicatedPlasmodiumvivaxmalaria[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2011, 5(12). DOI: 10.1371/journal.pntd.0001325

[16]Ranjitkar S, Schousboe ML, Thomsen TT, et al. Prevalence of molecular markers of anti-malarial drug resistance inPlasmodiumvivaxandPlasmodiumfalciparumin two districts of Nepal[J]. Malaria J, 2011, 10: 75. DOI: 10.1186/1475-2875-10-75

[17]Chehuan YF, Costa MRF, Costa JS, et al. In vitro chloroquine resistance forPlasmodiumvivaxisolates from the Western Brazilian Amazon[J]. Malaria J, 2013, 12: 226. DOI: 10.1186/1475-2875-12-226

[18]ElBadry MA, Existe A, Victor YS, et al. Survey ofPlasmodiumfalciparummultidrug resistance-1 and chloroquine resistance transporter alleles in Haiti[J]. Malaria J, 2013, 12: 426. DOI: 10.1186/1475-2875-12-426

[19]Mohammed A, Ndaro A, Kalinga A, et al. Trends in chloroquine resistance marker, Pfcrt-K76T mutation ten years after chloroquine withdrawal in Tanzania[J]. Malaria J, 2013, 12: 415. DOI: 10.1186/1475-2875-12-415

[20]Gama BE, Lacerda MVG, Daniel-Ribeiro CT, et al. Chemoresistance ofPlasmodiumfalciparumandPlasmodiumvivaxparasites in Brazil: consequences on disease morbidity and control[J]. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 2011, 106: 159-166. DOI: 10.1590/S0074-02762011000900020

Drug resistance ofPlasmodiumvivax

XU Xin1,LIU Huai-e1,LIU Yong-hua2,YANG Zhao-qing1

(1.DepartmentofParasitology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2.YunnanRuiliCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruili678600,China)

As a high lethality and global parasitic disease, malaria has been the worldwide attention, and the control of malaria has been listed as one of the world’s three major public health problems. Prevalence and spread of drug-resistance, especially the rapid spread of resistance, becomes the research focus ofPlasmodiumdrug-resistance detection, prediction and development of new drugs forPlasmodiumvivaxmalaria. According to these series problems, the currentPlasmodiumvivaxmalaria drug resistance test method, the molecular mechanism and hot spots ofPlasmodiumvivaxmalaria drugs were reviewed in this article.

Plasmodiumvivax; drug resistance; review

Yang Zhao-qing, Email: zhaoqing92@hotmail.com

国家自然科学基金(No.31260508;No.U1202226);教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No.20125317110001)

杨照青，Email：zhaoqing92@hotmail.com

1.昆明医科大学寄生虫学教研室，昆明 650500； 2.云南省瑞丽市疾病预防控制中心, 瑞丽 678600

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.016

R382.3

A

1002-2694(2015)01-0074-03

2014-03-07；

2014-10-02

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31260508 and U1202226) and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20125317110001)