携带汉坦病毒宿主动物分布特征研究

马超锋，余鹏博，吴 瑞，陈海龙，蔡正华，卢晓玲，王敬军，李恒新

携带汉坦病毒宿主动物分布特征研究

马超锋1，余鹏博2，吴 瑞1，陈海龙1，蔡正华1，卢晓玲3，王敬军2，李恒新1

目的 研究西安地区携带汉坦病毒(HV)宿主种类及分布特点。方法 夹夜法捕获宿主动物后鉴定种类，利用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测宿主动物肺脏中HV核酸。结果 2011-2013年在监测地域共捕获动物2 577只，鼠密度为3.28%，在9月份达到5.6%；其中黑线姬鼠(Aa)占63.4%，小家鼠(Mm)和褐家鼠(Rn)分别占18.98%和12.88%；312份动物标本中检出HV核酸，其中Aa占88.78%，Rn占5.12%，Mm占4.49%，在黄胸鼠(Rf)和北小社鼩(Cs)也检出HV核酸，在8月和9月捕获的阳性宿主占到了全部阳性的56.73%， 野外的阳性宿主占到了总阳性的87.82%。结论 西安地区鼠密度在9月达到高峰，鼠种主要为Aa，Mm和Rn，携带HV的动物有Aa，Rn，Mm，Rf和Cs等，形成了在野外以Aa为主，居民区以Rn 和Mm为主,阳性宿主动物主要出现在野外8月9月，这对本地区防控肾综合征出血热(HFRS)中宿主控制方面具有指导意义。

汉坦病毒；宿主动物；时空分布

肾综合征出血热(Hamorrhage Fever with Renal Syndrome, HFRS)是一种自然疫源性疾病，是由汉坦病毒(Hantavirus, HV)感染引起的一种急性传染病[1]。从目前发现的HV来看，几乎每种HV均和一种啮齿类动物宿主有关，病毒感染宿主后与宿主共生，一般不引起宿主动物发病。HV一般有较严格的宿主范围，一种病毒只感染某一种啮齿动物。病毒感染宿主动物后，排泄物(如尿液、粪便和唾液等)排泄在环境中，人类通过接触宿主排泄物而感染，这一特性是HV由宿主传给人类的关键。因此，宿主动物的分布界定了各种HV流行地域的不同。HV宿主动物的地理分布区与人类HFRS、HPS的自然疫源地和疫区分布基本吻合[2]。因此，检测鼠间HV感染情况，可对HFRS的防控提供依据。近年来，陕西省成为我国HFRS病例数最多的地域，西安地区自1956年报道首例HFRS病例以来，报告病例数一直占到全省病例数的70%以上[3]。为更有针对性地进行HFRS防控，对携带HV宿主在季节和空间上的分布提供依据，我们进行了本研究。

1 实验材料

1.1 标本 2011-2013年分别在在西安地区HFRS疫区户县和长安区按照《全国肾综合征HFRS监测方案》(试行)，选择监测点，用夹夜法捕鼠后，记录捕获宿主动物位置，运送至实验室进行宿主种群鉴别、称量体重、身长、右后足长及右耳长后，无菌解剖收集肺脏和心脏-80℃保存，肺脏分3等份分别进行抗原、核酸和病毒分离。

1.2 主要试剂和实验仪器 核酸提取试剂为Trizol(life technologies, 美国)，组织均质器为Tissuelyser(Qiagen，德国)，RT-PCR试剂为一步法RT-PCR试剂(life technologies, 美国)，Biorad公司CFX96实时荧光定量PCR仪(美国)，Thermoscientific公司酶标仪洗板机(美国)。

1.3 实验方法 按照试剂说明RT-PCR检测HV核酸。

1.4 统计学处理 利用Openepi，SPSS13.0进行数据处理及统计分析。

2 结 果

2.1 2011-2013年鼠密度情况 2011年在户县、长安两区县共布鼠夹18 961只，捕获动物331只，鼠密度为1.74%；2012年共布鼠夹18 865只，捕获动物533只，鼠密度为2.83%；2013年共布鼠夹40 700只，捕获动物1 584只,鼠密度为3.89%，3年中平均监测鼠密度为3.28%，按月鼠密度分布见图1。

2.2 2011-2013年捕获啮齿动物时间种类分布 2011-2013年共捕获动物2 577只，主要鼠种为黑线姬鼠(63.40%)，小家鼠(18.98%)，褐家鼠(12.88%)，在5、8、9、10四个月捕获的动物最多。

Aa:Apodemusagrarius; Rn:Rattusnorvegicus; Mm:Musmusculus; Md:Musdomesticus; Rf:Rattusflavipectus; Cs:Corcidurasuaveolens; Tt:Tscherskiatriton.

图2 2011-2013年两地宿主动物构成按月分布情况

Fig.2 Monthly distribution of host animal from 2011 to 2013

2.3 阳性啮齿动物种类、时间分布情况 2011-2013年共检出HV核酸阳性标本312份，总阳性率12.11%，其中野外鼠阳性率15.86%，居民区阳性率4.47%；黑线姬鼠阳性率16.72%，黄胸鼠12.50%，褐家鼠4.82%，小家鼠2.80%；阳性宿主中，黑线姬鼠最多(88.78%)，褐家鼠和小家鼠分别占5.12%和4.49%；具体鼠种阳性情况见下表1。在捕获阳性动物的时间分布来看，3年中第一季度均未捕获阳性动物，而8月、9月捕获的阳性动物占到了全部阳性的56.73%，阳性动物按月分布情况见图3。宿主分布统计显示野外的阳性数占总阳性数的87.82%。

Aa:Apodemusagrarius; Mm:Musmusculus; Rn:Rattusnorvegicus;

Cs:Corcidurasuaveolens; Rf:Rattusflavipectus.

图3 2011-2013年阳性动物种类按月分布情况

Fig.3 Monthly distribution of HV RNA positive animal from 2011 to 2013

3 讨 论

目前，对于HV在其宿主的感染状况调查，按照《全国肾综合征HFRS监测方案》(试行)要求，可使用IgG抗体、免疫荧光法检测HV抗原和RT-PCR法检测HV核酸。检测IgG抗体可用抗原片法和ELISA法，抗原片法要求检测者通过显微镜观察结果，主观性较强，加之目前抗原片供应不足，难以大批量进行；ELISA法检测IgG抗体可以用来进行大批量样本的调查，但目前市场上没有成熟的针对宿主动物HV IgG类抗体检测试剂盒，目前报道的研究结果均是各个实验室自行制备抗原包被后进行检测，结果的重复性和可比性较差。利用直接或间接免疫荧光法检测鼠肺中HV抗原，方法灵敏性较低，结果的判定主观性较强，因此也限制了本方法的使用。HV核酸检测特异、灵敏，但检测鼠肺中HV由于要对组织均质，使用组织研磨器，劳动量较大，标本之间容易交叉污染，所以限制了本方法的使用。在本次研究中，我们使用Qiagen公司生产的Tissuelyser组织均质器，实现了大量样本的同时操作，取得了满意的效果。Tissuelyser利用钢珠的上下振荡对组织进行均质，操作简便，重复性强，使用一次性离心管和钢珠，不存在交叉污染，可对批量标本同时处理，是组织核酸提取前处理标本的一种较好的方法。在本研究中，我们采用核酸检测方法对西安地区HV及其属主进行调查，使得大批量组织标本进行HV核酸检测结果真实可信。

在3年的调查中，宿主动物密度分别为1.74%、2.83%和3.89%，可以看出鼠密度在过去3年中逐步增高。鼠密度在9月达到最高值，3年来平均为5.6%，这与气候和农作物的生长周期密切相关，关中地区在9月份农作物逐渐进入收获季节，可为宿主动物提供更多食物，为宿主动繁衍提供条件。监测显示在这两个地区优势鼠种均是黑线姬鼠，占到总捕获数的64.3%；在野外捕获的动物中黑线姬鼠占到了87.26%，居民区占到了17.65%，而居民区小家鼠和褐家鼠分别占到47.18%和31.53%。西安地区HV宿主动物在野外以黑线姬鼠，在居民区以小家鼠和褐家鼠为主，但黑线姬鼠数量占绝对优势。

以往的研究显示，西安地区携带HV的宿主动物在1984年以前检测到的为黑线姬鼠，在1985年、1986年、1988年分别发现褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠和大仓鼠携带有HV抗原[4]。本次研究中我们以HV核酸为检测物，结果显示西安地区黑线姬鼠携带HV的数量远高于其他动物，形成在野外以黑线姬鼠携带HV为主、在居民区以小家鼠、褐家鼠携带HV为主的格局。时间分布显示携带HV的宿主动物在8月达到高峰，因此在每年夏末秋初野外活动时加强防范是减少HV感染的关键。

以往的调查显示西安地区携带HV的宿主有黑线姬鼠、褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠等啮齿动物，本次调查除在以上动物中检出HV外，在3只鼩鼱中检测HV核酸，其中1只经陕西省动物研究所鉴定，根据其生理特性和体貌特征鉴定为北小麝鼩(Corcidurasuaveolens,Cs)。Cs属于食虫目鼩鼱科，此前在我国曾报道在臭鼩(Suncusmurinus)和普通鼩鼱(Sorexaraneus)体内检测到汉坦病毒抗原。由于我们利用细胞培养技术未能在这3只动物标本中分离到HV病毒，而Cs由于体型较小，我们亦未能采集到更多标本进行进一步验证，因此关于Cs携带HV这一论断还需进一步研究[5]。

根据以往的研究结果，西安地区已经成为汉滩病毒(Hantaanvirus，HTNV)和汉城病毒(Seoulvirus，SEOV)混合疫区。2002年魏战臻等报道经对西安市户县1993-2000年间的233份病人血清利用血凝抑制实验进行病原学分型，结果显示约5%为SEOV型，提出西安地区成为HTNV和SEOV两型病毒共同流行的混合疫区[4]。2004年白雪帆等报道陕西省延安市爆发的HFRS疫情中扩增的HV序列经比对与SEOV序列同源性在94%，而与HTNV同源性仅有76%，提示延安地区有可能成为新的SEOV疫区[6]。在1990年以前的监测显示，西安地区只有Aa携带HV，而在其后的监测中，褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠等鼠种均检出携带有HV抗原[7]。由于HV与宿主之间有较严格的限制性，一般HTNV只在Aa中生存，而SEOV在Rn体内寄生，由此亦推断西安地区成为SEOV和HTNV混合疫区。我们对所有宿主动物中检出的HV均进行了病毒基因分型，分型结果均为HTNV型，未检出SEOV型。同时进行的HFRS病例标本病毒分型全部为HTNV型(内部资料)。

从目前发现的HV来看，除少数例外，几乎每种HV均和一种啮齿类动物宿主有关，病毒感染宿主后与宿主共生，一般不引起宿主动物发病。HV一般有较严格的宿主范围，一种病毒只感染某一种啮齿动物[8]。但后续研究显示，这种对应并不是非常严格，一种HV同样可以暂时或永久感染其它相近宿主，这一般发生在一个区域内生活有多种动物时，这种现象称为溢出感染(Spillover infection)[9]。Klingstom等曾报道普马拉病毒就从棕背鼠平溢出到普通田鼠和小林姬鼠，多不拉法病毒也从黄喉姬鼠溢出至小林姬鼠和Mm，我国四川省和天津市都从社鼠中分离到HTNV，也从社鼠体内分离到新型HV大别山病毒[10-11]。Zuo等在湖南小家鼠体内发现HTNV存在；同时从贵州Rn体内分离到HTNV，2013年我们从Rn体内检测HV RNA[9,12]。在这些宿主中均发生了HV的溢出感染。虽然西安地区在多种啮齿动物体内均检出HV，但宿主动物体内和病例携带HV分型监测均为HTNV, 因此我们认为西安地区仍然是HTNV的单一疫区。在实验中显示，黑线姬鼠携带的HV核酸数量明显高于其他几种宿主动物，因此溢出感染是一过性或可以形成新的传播宿主值得进一步研究。

综上所述，监测显示西安地区目前HV宿主动物主要是黑线姬鼠，小家鼠和褐家鼠，在野外以黑线姬鼠为主，在居民区以小家鼠和褐家鼠为主；数量上黑线姬鼠占绝对优势；而携带HV的宿主动物在8月达到高峰。在携带HV的动物类型和分布来看，野外的黑线姬鼠是携带HV的主要宿主，而进入居民区的黑线姬鼠也携带HV；小家鼠、褐家鼠和黄胸鼠以及野外的鼩鼱等也可携带HV，但这些宿主携带的HV仍然是HTNV，这种携带是一过性或已经形成新的感染源头需进一步研究。

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Spatial and temporal distribution of hosts carrying hantaviruses

MA Chao-feng1,YU Peng-bo2,WU Rui1,CHEN Hai-long1,CAI Zheng-hua1,LU Xiao-ling2,WANG Jing-jun2,LI Heng-xin1

(1.Xi’anCentreforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;2.ShaanxiCentreforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;3.HuxianCentreforDiseaseControlandPrevention,Huxian710030,China)

In this study, we aimed to observe the hantavirus (HV) hosts species and distribution characteristics in Xi’an City, Shaanxi Province, China. The small animals were captured by night-trapping and HV RNA was detected by real time RT-PCR in their lung samples. In the survey area from 2011 to 2013, 2 577 animals were captured and the average rodent density was 3.28% and reached 5.6% in September in these hosts.Apodemusagrarius(Aa) accounted for 63.4% of the host animal,Musmusculus(Mm) for 18.98%, andRattusnorvegicus(Rn) for 12.88%. There were 312 HV RNA positive lung samples (Aa 88.78%, Rn 5.12%, Mm 4.49%). HV RNA was also found inRattusflavipectus(Rf) andCrocidurasuaveolens(Cs). The HV RNA positive rate of hosts captured in August and September was 56.73%. The HV RNA positive hosts in field area accounted for 87.82% of total positive ones. The host density reached to the highest point in September and the main hosts of HV were Aa, Mm and Rn; the hosts carrying HV RNA were Aa, Rn, Mm, Rf, and Cs in Xi’an from 2011 to 2013. In the field area, Aa was the main HV host, and in residential area, they were Rn and Mm. The HV RNA positive hosts mainly appeared in the field area in August and September and this conclusion was important for the control and prevention of HFRS in Xi’an, China.

hantaviruses; hosts; spatial and temporal distribution

Li Heng-xin, Email: hengxinl27@163.com

李恒新，Email:hengxinl27@163

1.西安市疾病预防控制中心，西安 710054； 2.陕西省疾病预防控制中心，西安 710054； 3.陕西省户县疾病预防控制中心，户县 710300

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.006

R183.5

A

1002-2694(2015)01-0026-04

2014-04-15；

2014-10-14

陕西省自然科学基金( No.2011JM4010)

Funded by the Shaanxi Science and Technology Plan Project (No. 2011JM4010)