铁皮石斛组织培养研究进展

王 睿，潘凌洁，柯旭波，詹 妮，童霞秀，于 超，王华森

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

铁皮石斛组织培养研究进展

王 睿，潘凌洁，柯旭波，詹 妮，童霞秀，于 超，王华森*

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

综述了铁皮石斛（Dendrobium officinale）组织培养研究进展，铁皮石斛的组织快繁主要通过种子无菌萌发、试管苗原球茎发生和试管苗器官发生3种途径；铁皮石斛的基本培养基为MS、B5、N6、RM和Fonnesbech，但对最适培养基的选择却不同，主要在于外植体来源不同所致；铁皮石斛在不同生长发育阶段所需激素的量和种类都不相同，目前，铁皮石斛组织培养中常使用的外源激素主要是生长素类（如IAA、IBA、NAA等）和细胞分裂素类（如BA、ZT和KT）；添加剂的使用在铁皮石斛的组织培养快繁体系的建立中具有重要的意义，常用的添加剂为香蕉汁、椰子汁、马铃薯泥、苹果汁、荸荠汁等；此外，碳源、温度及光照对铁皮石斛组培苗生长发育都有影响。

铁皮石斛；组织培养；研究进展

铁皮石斛（Dendrobium officinale）又称黑节草、铁皮兰，属兰科(Orchideceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生性草本植物，是我国传统的名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热功效[1]；民间称其为“救命仙草”[2～3]。多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，加上长期采挖，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭[4～5]。铁皮石斛的种子极小、无胚乳，需结合共生菌才能正常萌发，故实生苗的栽培难度较大[6]。传统的无性繁殖方式繁殖系数低，大面积栽培种苗数量无法得到满足。为了满足市场的需求，国内许多研究人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究，取得了不少进展。本文综述了近年来关于铁皮石斛组织培养的研究概况，并分析存在的问题及发展的方向，为铁皮石斛人工快繁提供参考。

1 研究概况

1.1 外植体的选择

外植体作为植物组织培养中离体培养材料的来源，原则上可采用铁皮石斛的任何部位，但是不同部位不同发育阶段的植物材料对诱导反应条件不同。因此铁皮石斛组织培养过程中，研究人员试验过不同种类的外植体。叶秀嶙等[7]将2-6个月种龄的种子进行组织培养发现萌发率不一样，种龄越长萌发率越高，组织培养应采用健康、老熟的种子。铁皮石斛的茎段也能很好的诱导器官发生，取铁皮石斛当年生幼嫩茎，切成长度为1.0 ～ 1.5 cm 带1 ～ 2个腋芽的小茎，进行离体培养，可以诱导出不定芽[8～9]。近几年，铁皮石斛的组织快繁主要通过种子无菌萌发、试管苗原球茎发生和试管苗器官发生3种途径。

1.2 培养基的选择

铁皮石斛的基本培养基为MS、B5、N6、RM和Fonnesbech[10～11]，但对最适培养基的选择却不同，主要在于外植体来源不同所致。对铁皮石斛种子无菌萌发及发芽率的研究表明，铁皮石斛种子可在1/2MS、改良KC、改良N6培养基上生长，且最高萌发率可达100%[12]。铁皮石斛的原球茎增殖可以选用1/2MS[13]、MS培养基[14～16]。鲍腾飞[17]等认为最有利于铁皮石斛类原球茎生长增殖的基本培养基为1/2MS。方炎明[18]和单芹丽等[19]分别选用茎尖和蒴果为外植体在1/2MS培养基进行组织培养。詹忠根等[20]离体根尖培养选用B5培养基。蒋向辉等[21]将幼叶做为外植体，选择MS培养基。朱艳等[22]以铁皮石斛茎段诱导丛生芽作为目的，筛选出1/2MS诱导丛生芽的效果好，生成的苗粗壮。

1.3 激素对铁皮石斛组织培养的影响

铁皮石斛在不同生长发育阶段所需激素的量和种类都不相同。针对不同的培养目的及培养阶段，探寻各种激素的最佳配比一直是研究的热点。目前，铁皮石斛组织培养中常使用的外源激素主要是生长素类（如 IAA、IBA、NAA等）和细胞分裂素类（如BA、ZT和KT）。

郑志仁等[23]研究了植物生长调节剂对铁皮石斛种子萌发、原球茎增殖与分化、试管苗生根的影响，结果表明，铁皮石斛种子萌发的适宜培养基为MS＋0.5mg/L NAA＋10%土豆汁；原球茎增殖与分化的适宜培养基为MS ＋0.5mg/L 6-BA＋0.1mg/L NAA＋10%土豆汁；试管苗生根的适宜培养基为MS＋0.2mg/L NAA＋10%土豆汁。陈兆贵[24]等认为最佳激素配比为1.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L KT，接种35 d铁皮石斛原球茎增殖倍数达5倍。罗吉凤[25]等研究结果表明，原球茎分化适宜的激素浓度为2 mg/L BA、0.2mg/L NAA和0.1mg/L IBA。蒋波等[26]报道了2.0 mg/L BA＋0.5mg/L NAA或3.0mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA适宜铁皮石斛原球茎增殖。莫昭展等[27]研究表明，在改良MS中加入0.5 mg/L ABA，原球茎增殖的效果比较好。李璐[28]比较了6-BA和TDZ对铁皮石斛花芽诱导的影响，结果表明，0.2 mg/L TDZ最适宜诱导其开花。张治国等[29]报道了2 mg/L BA＋0.2 mg/L NAA组合加快原球茎分化进程。谢启鑫等[15]研究表明0.5 mg/L BA＋0.5 mg/LNAA组合适宜试管苗的增殖分化。秦廷豪[30]研究表明以铁皮石斛无菌苗分成的茎段、带顶芽的茎段和根蔸类外植体在MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA上均能诱导出丛芽，只有根蔸能诱导原球茎, 且诱导丛芽倍数高于其它两类。常美花等[31]研究表明1.0 mg/L 6-BA＋0.5mg/L NAA为铁皮石斛原球茎增殖的最佳浓度。张红兵等[9]研究表明铁皮石斛茎段腋芽诱导最佳的培养基为MS＋1.0 mg/L NAA＋3.0 mg/L 6-BA，诱导率达到95%；向培养基中加入活性炭2 g/L或维生素C（Vc）2.5 g/L均能有效地防止外植体褐化；诱导铁皮石斛幼苗生根的最佳培养基为1/2MS＋2.0mg/L IBA，生根率在90%以上。唐桂香等[13]研究表明，0.5 mg/L NAA对铁皮石斛的生根效果最好。宋顺等[32]研究结果表明：最适合铁皮石斛原球茎诱导的培养基为MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.5 mg/L NAA，原球茎诱导率为95%；最适合原球茎增殖的培养基为MS＋6-BA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L；最适合原球茎分化的培养基为MS＋5 mg/L 6-BA＋1 mg/L NAA，其分化率达80%；最适合铁皮石斛根诱导的培养基为MS＋1.5 mg/L IBA＋香蕉泥100 g/L，其生根率为100%。罗焕明等[33]以无菌播种取得的铁皮石斛无菌苗作为试验材料，研究1/2MS培养基中添加不同浓度的添加物对铁皮石斛的增殖、生根的影响，结果表明：以1/2MS＋0.2 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋200 g/L马铃薯培养基最有利于诱导芽的增殖，其中又以1/2MS＋0.5 mg/L NAA＋30 g/L蔗糖＋100 g/L香蕉培养基最有利于诱导芽生根。

1.4 添加剂对铁皮石斛组织培养的影响

添加剂的使用在铁皮石斛的组织培养快繁体系的建立中具有重要的意义。常用的添加剂为香蕉汁、椰子汁、马铃薯泥、苹果汁、荸荠汁等[34]。椰子汁、苹果汁[35]对铁皮石斛原球茎增殖有较好的效果，添加马铃薯汁[12,22]能有效促进原球茎的分化；马铃薯汁和木瓜乳有利于诱导芽的增殖[36]，香蕉汁有利于诱导生根，宋顺等[32]也报道了香蕉汁有利于诱导生根：郑志仁等[23]认为土豆汁利于铁皮石斛的种子萌发，有利于原球茎增殖与分化。然而张治国等[29]认为原球茎增殖时最好不要添加任何天然提取物。添加活性炭能使原球茎的增殖量显著增加[25,35～36]，这可能是活性炭吸附了某种不利于原球茎增殖的物质[36]。

1.5 碳源

周根余等[37]研究了不同碳源对铁皮石斛原球茎生长的影响，发现原球茎在蔗糖中生长最快，浓度3%，葡萄糖中其次，而乳糖中最慢。而冯莹等[38]报道了白糖对铁皮石斛原球茎的培养效果优于蔗糖。陆兵[36]认为原球茎分化中，蔗糖浓度以3%为分化的临界值，蔗糖2%为原球茎分化的适宜浓度。

1.6 温度及光照

鲍顺淑等[39]研究了光照强度对铁皮石斛组培苗生长发育的影响，以期找到铁皮石斛组培阶段在人工光可控环境下的适宜光照环境，结果表明铁皮石斛组培苗在人工光型密闭式植物工厂内培育的适宜光照强度为60 ～ 70 μmol/（m2·s），光照强度为92 μmol/（m2·s）时有利于铁皮石斛组培苗多糖的积累，但其生理活性受到一定的光抑制。唐丽等[40]研究表明在组织培养和快速繁殖中，当培养温度为25℃时，原球茎增殖效果最佳；当温度≥25℃时，分生苗数量增多；温度≤23℃时，生根苗生长健壮高大。

2 展望

据报道，截止2012年6月，全国铁皮石斛组培苗年产量约4亿株，浙江、云南分别有2亿株和1.3亿株，全国种植面积达到2 100 hm2，并且云南铁皮石斛的种植面积仍以每年40% ～ 50%的速度在扩大。正是由于铁皮石斛组织培养繁殖技术的快速发展才推动了铁皮石斛的大规模生产。同时对濒临灭绝的野生铁皮石斛资源有缓解作用。然而，铁皮石斛标准化种苗生产体系所需成本偏高，生产周期偏长，市场价格比较昂贵，不同品种及生长条件下的药用成分含量造成了铁皮石斛的品质不同。针对上述问题，今后要解决是，加强铁皮石斛优良品种的选育，进一步控制原球茎增殖和分化的时间，提高试管苗的生长速度，探讨生长环境对铁皮石斛的生长发育的影响，有利于组培苗移栽到大田里更好地生长以及药用成分的积累。这样才能从根本上解决上述存在的问题。

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Advance on Research of Tissue Culture of Dendrobium officinale

WANG Rui，PAN Ling-jie，KE Xu-bo，ZHAN Ni，TONG Xia-xiu，YU Chao，WANG Hua-sen*
（School of Agriculture and Food Science, Zhejiang A ＆ F University, Lin’an 311300, China）

Descriptions were made on researches on tissue culture of Dendrobium officinale involving selection of explants, minimal medium, exogenous hormones and their concentration, additives, as well as on carbon source, temperature and light.

Dendrobium officinale; tissue culture; research

S723.1+32.6

A

1001-3776（2015）05-0080-05

2015-03-21；

2015-06-11

浙江省基金（Y3110340, LQ12C15002）；浙江省科技厅重大专项（2010C02003）；浙江省公益性项目（2012C22019）；2012浙江省“三农六方”农业科技协作计划项目（113-2045210160）；浙江农林大学“国家级大学生创新创业训练计划”（201410341020）；2014年浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2014R412032，2014R412039，2014R412031）；2013年浙江农林大学创新创业训练计划项目（201301012，201301006，201312004，201312021）

王睿（1996-），男，浙江宁波人，从事农业科学研究；*通讯作者。