酵母细胞壁多糖的作用及其成分检测方法

徐智鹏，胡骏鹏，周小辉

（安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

酵母细胞壁多糖是一种源于酵母的天然高效免疫增强剂，其主要功能成分为甘露聚糖和β-1，3/1，6葡聚糖（以下称 β-葡聚糖）。 甘露聚糖是寡糖一种，其相对分子质量为2000～20000，主链由几十个甘露糖分子以α-1，6糖苷键组成，支链由几个甘露糖通过α-1，2和α-1，3相连。酵母β-葡聚糖不同于植物细胞壁中的β-1，4葡聚糖，作为来源于酵母细胞壁的重要结构物质，由10～20个单糖组成特异性结构的多糖，主链由D-葡聚糖通过β-1，3键的方式相结合，支链由β-1，6键结合的多聚糖（周祥等，2013）。

1 酵母细胞壁多糖的作用

1.1 调节肠胃环境 研究发现，病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌和弧菌等的细胞表面都含有凝集素，其能特异性识别动物肠壁细胞上的“特异性糖类”受体，并与该受体结合而附着于肠壁上，在肠壁上发育繁殖，分泌毒素，导致肠道疾病的发生（刘源等，2007）。酵母细胞壁的功能性成分甘露聚糖与病原菌在肠壁上的受体结构非常相似，并与凝集素有很强的结合能力。凝集素一旦与甘露聚糖结合便无法继续附着于肠壁上，由于病原菌不能利用甘露聚糖，导致缺乏能量而死亡并排出体外。而有益菌如双歧杆菌、乳酸杆菌等可以以甘露聚糖为能源，甘露聚糖进入消化道后段经浓缩才能被动物消化道菌群中的有益菌选择性发酵利用， 以有机酸、CH4、CO2、H2的形式释放或参与代谢，提供能量。因此，在饲料中添加甘露聚糖能阻止病原菌等有害菌的定植而减少其含量，且有助于肠道有益菌的增殖。

1.2 提升免疫力 酵母β-葡聚糖是天然的免疫增强剂，能提高机体的非特异性免疫和特异性免疫功能，具体表现在能够刺激细胞毒性T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞发挥其功效，同时还能增加抗氧化因子发挥功效，且可以充当佐剂的作用，与抗生素共同作用能增加其效力。Courie等（2005）用酵母β-葡聚糖替代抗生素添加到猪、鸡等畜禽日粮中，显著提高猪、鸡的免疫功能，同时可促进生长，提高饲料转化利用率。杨文鸽等（2006）研究表明，羧甲基β-葡聚糖提高了大黄鱼的非特异性免疫功能，具体表现在大黄鱼血液中的白细胞数和吞噬能力上，同时血清中溶菌酶和酚氧化酶活力增加。Selvaraj等（2005）研究表明，对鲤鱼进行腹膜内注射酵母葡聚糖可显著提高其免疫能力。Chang等（2000）研究报道，在虾日粮中添加酵母β-葡聚糖能够增强血细胞的吞噬活性、细胞黏附力和活性氧的产生。超氧化物歧化酶（SOD）是生物体内自由基清除酶，在抗氧化方面起着积极的作用。在对β-葡聚糖的抗氧化活性研究中表明β-葡聚糖可使试验鼠血清中的SOD活力增加，且具剂量依赖性（王玥玮，2012）。酵母β-葡聚糖能明显增加抗生素的效力，当与抗生素联合使用时，其刺激巨噬细胞的作用能够增强药物的治疗效果。大鼠腹膜炎的试验证实，单独使用β-1，3-D-葡聚糖的大鼠有80%的存活率（对照组的存活率为20%），单独使用抗生素组的存活率为65%，而联合使用二者则有100%的存活率（张海波和张彦，2010）。

1.3 吸附霉菌毒素 研究表明，酵母细胞壁多糖功能成分有很多结合位点，通过氢键、离子键、疏水作用力以及直接结合的方式，能够吸附黄曲霉毒素、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，结合力呈非直线关系。与普通的无机霉菌毒素吸附剂单纯通过正负电荷吸附不同，细胞壁多糖功能性成分对霉菌毒素的吸附具有针对性，其对玉米赤霉烯酮有超强的结合力并且不会损失维生素等饲料中的有益成分。Raju和Devegowda（2000）研究表明，细胞壁多糖功能性成分可缓解黄曲霉毒素、T-2毒素和赭曲霉毒素对肉鸡生产性能的不利影响。体外试验研究表明，细胞壁功能性成分对黄曲霉毒素（B1、B2、Gl、G2）、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等霉菌毒素的结合能力很强，分别为85%、67%和67%；对T-2毒素的结合率为33%；对赭曲霉素、呕吐毒素、桔青霉素（citrlnin）和蛇形霉素的结合率为12%～18%；但对雪腐镰孢菌烯酮和镰孢菌酮-X的结合率仅为8%（姚丽欣，2011）。还有体外试验表明，酵母甘露寡糖对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素的吸附率分别为95%、77%、59%，但对呕吐毒素吸附率仅为12%（姚丽欣，2011）。体外模拟试验发现10 min内可吸附10%的玉米赤霉烯酮（侯然然，2007）。Stefan等（2003）报道了β-1，3-D-葡聚糖衍生物对玉米赤酶烯酮具有较好的吸附效果，最大吸附量可达183 mg/g。Yiannikouris（2004）研究报道，酵母源 β-D-葡聚糖的三维结构特征在吸附霉菌毒素过程中起了关键的作用；利用分子模型定位了玉米赤霉烯酮与β-D-葡聚糖间相互作用的空间构造和互作分子位点；并证实霉菌毒素和葡聚糖间的主要交互作用力来源于氢键与范德华键的堆垛互作。张丽霞（2006）研究表明，采用酶碱法制备的葡聚糖维持了三股螺旋结构，对玉米赤霉烯酮具有较好的吸附效果，最大吸附量可达到2.296 mg/mg葡聚糖。

2 酵母细胞壁多糖功能性成分检测方法

由于酵母葡聚糖是不溶性多糖，并与甘露聚糖、蛋白质等物质相互结合，所以其定量测定难度较大。目前检测酵母细胞壁中功能性成分主要采用酶法和液相色谱法。

2.1 酶解法 首先在碱性条件下溶解酵母葡聚糖，然后在酸性条件下用葡聚糖酶水解成单糖。将β-1，3/1，6-D 葡聚糖、β-1，3/1，4-D 葡聚糖、β-1，3-葡聚糖在搅拌的条件下，用2N KOH溶解或水解，溶液随后用1.2 mol/L醋酸钠调节pH至4.0～4.5，该浆状溶液用Glucazyme酶在40℃下酶解16 h，稀释离心，通过GOPOD试剂检测葡聚糖的含量。连喜军等（2006）在试验中将样品与多糖水解酶混合反应，过滤后与纯化后的葡萄糖苷酶反应，采用葡萄糖氧化酶、过氧化物酶试剂分别测定标准葡聚糖和样品酶解后得到葡萄糖浓度，对照葡聚糖标准品酶解后得到的葡萄糖浓度与标准葡聚糖浓度的关系，与在相同条件下样品酶解得到的葡萄糖含量进行比对，求出样品中β-葡聚糖含量。

2.2 高效液相色谱法 根据葡萄糖和甘露糖在流动相和液相色谱柱的固定相之间具有不同的分配系数，将水解后的样品注入液相色谱，用纯水作流动相，糖类分子流出后，经示差检测器检测，用外标法定量。在β-葡聚糖和甘露寡糖水解时，由于样品可能存在水解不彻底，以及水解产生的葡萄糖和甘露糖由于高温造成部分发生其他副反应，导致检测结果比产品中实际含有的β-葡聚糖和甘露寡糖偏低。检测中可采用葡聚糖对照品对上述水解过程引起的误差进行修正。陈少峰等（2009）采用高压水解高效液相色谱法测定酵母葡聚糖中葡聚糖含量，优化得到了最佳的水解方式，同时与标准直链β-1，3-D-葡聚糖进行相同条件下处理的结果对照，对测定结果进行校正，RSD为1.11%，该方法快速简单，测定结果准确（陈少峰和望忠福，2009）。

3 小结

酵母细胞壁多糖的主要作用体现在激发、增强机体的免疫力，抗病和抗感染力，维护肠道微生物平衡，抑制有害菌繁殖，减少霉菌毒素对动物的影响，而且无毒副作用，无耐药性，无污染。但对于酵母细胞壁功能成分的定量检测难度较大。目前，多采用酶解法和高效液相色谱法。其中，高效液相色谱法误差较小，同时便捷省时。

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