RNAI-基因敲除技术及其在肿瘤研究中的进展

RNAI-基因敲除技术及其在肿瘤研究中的进展

王佳

(天津市天津医院，天津300211)

关键词〔〕基因敲除； RNAI-基因敲除技术；肿瘤

中图分类号〔〕R73〔文献标识码〕A〔

第一作者：王佳(1973-)，男，硕士，主治医师，主要从事创伤骨科研究。

基因敲除技术又被称为基因编辑技术，是采取不同方式对原有的基因予以切断，然后安插新基因的技术。RNAI-基因敲除技术是一种重要的基因敲除技术，被广泛应用于对各种疾病治疗的研究之中。其中，在肿瘤治疗相关研究中的应用十分突出。受到自身高度特异性和高效性的影响，从细胞水平角度进行分析，RNAI成为一种十分理想的基因敲除工具〔1〕。后基因组时代，在进行各种功能基因组学研究的过程中，RNAI逐渐引起人们的广泛关注，并成为一种十分重要的研究手段。目前RNAI在多种病毒感染性疾病以及肿瘤治疗的研究中都得到了大量的应用，并取得一定的理论和实践成果。笔者即对RNAI-基因敲除技术及其在肿瘤研究中的进展情况作一综述。

1RNAI-基因敲除技术概述

1.1RNAI-基因敲除技术基因敲除技术是通过一定的基因工程途径，对机体内特定的基因予以不同的处理使其发生缺失或者失活的技术〔2〕。多种条件会引起基因敲除，包括基因突变和同源重组以及RNAI等。其中，RNAI-基因敲除技术是一种重要的类型。RNA表示核糖核酸，是一种特殊的“化学信使”，在多种疾病的发生和发展过程中都发挥着十分重要的作用。借助RNAI可以关闭特定基因的表达，RNAI-基因敲除技术又被称为核糖核酸干扰，是单分子RNA分裂时出现的某种蛋白质合成受到抑制的现象。RNAI基因敲除技术是一种mRNA水平上的基因沉默机制，具有高度的特异性。RNAI由内源性或外源性dsRNA诱发，在细胞内，一定的条件下，dsRNA会被切割成21～25 nt具有较小干扰性的RNA，即siRNA。siRNA可以通过介导识别方式，对同源性靶mRNA分子进行一定的靶向切割，从而对该基因功能产生一定的影响，导致其出现无法表达的情况。1994年，有学者通过对华丽新小杆线虫早期胚胎的分析研究，发现在其RNA的发育过程中，在分配体细胞和生殖腺细胞的时候，胚胎早期大部分RNA转录本会在较短的时间内即发生降解。但是，如果在胚胎中导入具有阻抑效应的外源性RNA，便可以产生较强的阻抑效应，并持续到下一代。1995年，有学者在对华丽新小杆线虫par1基因相关功能进行研究的时候，在新小杆线虫中导入par1基因的反义RNA，获得par1基因缺陷引起的par1拟表型。并通过进一步研究发现，在导入par1基因之后，在相应的意义链上，也会产生par1拟表型，这一par1拟表型与导入par1基因的反义RNA是相同的。研究结果表明，反义RNA以及有意义RNA均可以发挥出相似的阻抑效应。还有学者对此进行了进一步的深入研究，并通过研究提出，在通过一定的途径和方式被摄入机体细胞中之后，双链RNA可以对其同源基因(靶基因)的表达产生很强的特异性抑制作用。最终，学者还将这一双链RNA命名为 “RNAI”〔3～5〕。

1.2RNAI-基因敲除技术的机制和特点RNAI-基因敲除技术的应用过程中，会利用一定的基因工程途径，对机体内特定的基因予以不同的处理。通过一定的处理，会出现相应的基因缺失或者失活现象。在RNAI的效应阶段，siRNA双链会与一个核酶复合物发生结合，并构成一个RNA诱导沉默复合物(RISC)。在对RISC进行激活的时候，需要通过一定的过程。在距离siRNA3'端一定的位置，需要切割相应的mRNA。但是关于切割的确切机制，目前尚缺乏十分清楚的结论。但是，在每个沉默复合物中，都包含一个不同于Dicer的RNA酶以及一个siRNA。在临床治疗应用过程中，主要是通过清除细胞病毒途径和“关闭”病原体特定基因途径。清除病毒途径是应用分子中独有的生物活性分子，同时致使病原体基因mRNA形成含药靶点标记；永久“关闭”病原体特定基因途径，是临床提取患者自体病基因mRNA含药靶点标记，通过体外RNAI生物转录合成的专项抗体因子来阻断病原体生物复制链、致使病原体相应蛋白质无法合成，继而达到永久“关闭”病原体特定基因的作用。这条途径治疗过程中只是“关闭”病原体特定基因，而对正常基因本身无损害。RNAI-基因敲除技术具有十分明显的特点。首先，该技术具有易操作性。现如今，很多生物技术公司已经研制并生产出有效的RNAi 载体，从而为各种疾病的治疗提供了更多有利条件。其次，在对基因表达进行抑制的过程中，RNAI-基因敲除技术具有十分明显的高效性。另外，RNAI-基因敲除技术还具有十分明显的序列特异性〔6〕。

2RNAI-基因敲除技术在肿瘤相关研究中的应用

RNAI-基因敲除技术的应用范围十分广泛，可以被积极地应用于各种肿瘤相关研究之中。

2.1RNAI-基因敲除技术用于抑制癌基因表达每个人体内都有原癌基因，绝对不是每个人体内都有癌细胞。原癌基因主管细胞分裂、增殖，而且人体里还有抑癌基因。平时，原癌基因和抑癌基因维持着平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量会变大，而抑癌基因却变得较弱。因此，致癌因素是启动癌细胞生长的“钥匙”，主要包括精神因素、遗传因素、生活方式、某些化学物质等。多把“钥匙”一起用，才能启动“癌症程序”；“钥匙”越多，启动机会越大。肿瘤可以为良性和恶性。原癌基因的活化包括多种情况，例如染色体重排和插入突变、点突变、基因扩增。对于上述不同类型的活化癌基因mRNA而言，均可以通过RNAI技术对其产生有效抑制，从而达到对肿瘤生长有效抑制的目的。

2.1.1RNAI-基因敲除技术用于敲除点突变激活的癌基因在敲除点突变激活癌基因，可达到理想肿瘤治疗效果的过程中，RNAI技术是一个十分理想的工具。k-ras是一种原癌基因，当k-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。对于发生突变的ras基因而言，与正常细胞中存在的野生型ras基因进行比较可以发现，二者之间存在较大的相似性，仅有一个碱基不同〔7〕。但是，RNAI具有高度的特异性，因此可以专门针对肿瘤细胞中发生突变的ras基因发挥作用，产生较强的抑制效果。而对于正常细胞中存在的野生型ras基因，则不会产生抑制。利用逆转录病毒载体shRNA表达系统进行实验，可以在体外环境下对Capan-1胰腺癌细胞内k-ras基因的表达产生特异性的抑制。另外，也可以对裸小鼠移植瘤的生长产生较为明显的抑制作用。

2.1.2RNAI-基因敲除技术用于抑制基因扩增在肿瘤的发生和发展过程中，原癌基因会发生基因扩增现象。在基因扩增过程中，原癌基因可以在原来染色体上，利用一定的机制，通过复制达到多个拷贝数〔8〕。于是，通过扩增，相关表达产物的数量会出现异常增多的情况，细胞大量增殖。在多种上皮性肿瘤中，表皮生长因子受体EGFR(ErbB1)都会出现基因扩增的情况，并对肿瘤的发生产生极大的影响〔9〕。以往还有研究发现，采用化学合成方式可以获得实验所需的anti-erbB1 siRNA，并对A431细胞内erbB1的表达予以有效抑制，从而促进细胞凋亡的增加，并削弱肿瘤的增殖。

2.1.3RNAI-基因敲除技术用于抑制融合基因表达在各种肿瘤的发生和发展过程中，染色体重排指的是癌基因从原本所在染色体位置上发生转移，到达另一个染色体某一位置上的过程中〔10〕。这一过程会对相应的调控作用产生影响，导致其被激活。于是，大量异常基因产物出现，细胞出现恶性增殖。在人9号染色体上存在C-ABL基因，22号染色体上存在BCR基因，在一定的条件下，两种基因发生易位，并会导致无关基因出现融合，最终形成BCR/ABL融合基因〔11〕。BCR/ABL融合基因是慢性髓性白血病(CML)致病的始动和核心因素，并与疾病的发生存在十分密切的联系〔12〕。而利用RNAI-基因敲除技术，则可以对相应的融合基因mRNA表达予以有效抑制，达到控制疾病的目的。

2.2RNAI-基因敲除技术用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因的表达在各种肿瘤的发生和发展过程中，除了与癌基因被激活有关之外，还会出现多种形式基因的改变。具体来看，肿瘤的发病机制会受到诸多因素的调控，其中，细胞凋亡障碍是一个重要的机制〔13〕。在细胞凋亡方面，涉及到诸多类型的基因，包括Bcl-2基因和raf-1基因等。而RNAI-基因敲除技术在对各种肿瘤的发生和发展过程进行抑制过程中，其作用的发挥便与各种凋亡基因之间存在一定的关系。Bcl-2基因是Bcl家族中重要的抗细胞凋亡基因，它能够抑制细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展、预后之间存在十分密切的联系〔14〕。Bcl-2则可抑制细胞凋亡，其异常表达也与癌症的发生、发展及预后密切相关，因为细胞凋亡是人体的自然过程，该过程可迫使受损细胞死亡，而Bcl-2基因却帮助癌细胞继续存活〔15〕。raf-1基因也是一种抗凋亡基因，并和白血病的发生以及临床耐药之间具有十分紧密的联系。因此，临床对肿瘤进行治疗的过程中，可以通过对Bcl-2和raf-1mRNA表达的抑制，达到对白血病细胞等的增殖予以有效抑制的目的〔16〕。在肿瘤治疗过程中，对肿瘤血管生成予以有效抑制是一个十分重要的策略，而利用RNAi-基因敲除技术，通过anti-VEGF siRNA可以对抑制相关因子的表达，以抑制肿瘤生长〔17〕。另外，各种肿瘤的临床治疗过程中，耐药是一个十分突出的问题。耐药性的存在会对多种类型肿瘤的临床治疗产生不利影响，并与多药耐药基因的表达之间存在一定的关系。为此，通过anti-MDR siRNA，便可以达到很好的抑制细胞耐药的效果，提高临床治疗水平。

3RNAI-基因敲除技术应用于肿瘤研究中的问题

RNAI-基因敲除技术应用于肿瘤研究中的过程中，虽然获得了一定的研究成果，但也仍然存在一定的问题。长期以来，RNAI-基因敲除技术的毒理作用一直是一个重要的研究内容〔18〕。在机体中，干扰素是一种十分重要的物质，可以对机体内多种不同的代谢途径予以有效激活，并对RNaseL降解mRNA产生一定的诱导作用，从而对机体内正常的细胞代谢过程产生影响〔19，20〕。而RNAI技术则会对干扰素的出现产生一定的影响，从而对正常细胞产生一定的不利影响。另外，关于RNAI在体内的具体作用方式相关细节问题，目前仍然缺乏十分系统、明确的阐释。还有研究指出，HBV病毒的RNAI会对细胞产生较强的毒性作，导致大面积正常细胞出现死亡。但关于其具体的作用机制，至今尚不甚清楚。另外，在RNAI抗性方面，也存在一定的问题。如果通过自身形成另一种较为特殊二级结构或者RNA结合特异性的蛋白的方式来对RNAI结合位点予以封闭，会导致RNAi作用的下降。另外，在RNAI治疗方面，也面临一定的问题。在获取siRNA的过程中，存在一定的难度〔21〕。而如果采用化学方式进行合成，又会对其自身稳定性产生不利影响〔22〕。而且，在具体的治疗过程中，如何进行导入也是一个十分棘手的问题。如果采用常规肌肉注射或者静脉注射的方式，在体内siRNA的存在时间很短，无法有效发挥持久的作用，临床效果不甚理想。

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〔2015-07-01修回〕

(编辑曲莉)