安丘市鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

张 强 张录娟

（山东省安丘市畜牧局,山东安丘 262100）

安丘市鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

张 强 张录娟

（山东省安丘市畜牧局,山东安丘 262100）

该试验从安丘市部分鸡场无菌采集疑似大肠杆菌病的37只病死鸡的心血和肝脏，进行病原菌的分离鉴定和药敏试验。结果共分离出大肠杆菌21株，其中，有16株对小鼠具有致病性。用临床上常用的22种抗生素纸片对分离出的致病性大肠杆菌进行药敏试验，发现分离的鸡源大肠杆菌均对菌必治（头孢曲松）敏感，对丁胺卡那霉素（阿米卡星）、先锋噻肟、氨曲南和复达欣（头孢他啶）4种药物也具有较高的敏感性，其敏感率分别为87.5%、87.5%、81.3%和75%，对环丙沙星、克拉霉素、万古霉素和红霉素完全耐药。本试验结果为山东安丘地区鸡场合理用药防控大肠杆菌病提供了参考。

鸡 大肠杆菌 分离鉴定 药敏试验

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌感染所引起的一种传染病，不同品种和日龄的鸡均可发病，但肉用仔鸡最易感。在临床上鸡大肠杆菌病可表现为精神沉郁、消瘦、腹泻和呼吸困难等，病理剖检表现为心包炎、肝周炎、气囊炎、脐炎、关节炎等，发病率高，死亡率也高。此外，大肠杆菌可与其他呼吸道疾病，如慢性呼吸道病混合感染而使鸡的死亡率升高。在引起鸡发病的细菌性病原中，大肠杆菌病占据了首位[1]。由于大肠杆菌血清型众多，不同血清型大肠杆菌之间无交叉保护性，因此，主要通过抗菌药物来防治大肠杆菌病。然而，抗生素的使用不当会导致细菌产生耐药性。随着近年来我国养殖业的快速发展，以及抗菌药物在鸡大肠杆菌临床治疗中应用率的逐渐提高，大肠杆菌的耐药性问题也逐渐引起了人们的关注。为了更好地了解安丘地区引起鸡发病的致病性大肠杆菌的药物敏感性，以指导该地区养鸡中合理用药，本试验对临床上疑似鸡大肠杆菌病的病料进行了分离鉴定，并进行致病性试验和药物敏感试验，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

疑似大肠杆菌感染的37份病料来自于安丘市13个不同规模的养鸡场，无菌采取有典型病变的心血和肝脏组织以备细菌的分离和鉴定。

1.1.2 培养基及药敏纸片

牛肉膏、蛋白胨、普通营养琼脂、麦康凯琼脂及各种微量发酵管，药敏纸片包括头孢唑啉、头孢他啶、头孢呋辛、万古霉素、妥布霉素、链霉素、呋喃妥因、丁胺卡那霉素（阿米卡星）、庆大霉素、克拉霉素、红霉素、左氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、先锋噻肟、氟嗪酸（氧氟沙星）、菌必治（头孢曲松）、氨曲南、氟哌酸（诺氟沙星）、利福平、复方新诺明和复达欣（头孢他啶），购自杭州天和微生药试剂有限公司。

1.1.3 试验动物

昆明系健康小白鼠66只，体重为20～23 g／只，购自山东畜牧兽医职业学院。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养和镜检

取病死鸡的肝和心血接种于营养肉汤，37℃培养24 h。然后挑取细菌在营养琼脂和麦康凯琼脂平板上划线接种，37℃培养24 h，观察细菌的培养特性，并进行涂片，革兰氏染色镜检，观察其形态。再钩取单个典型菌落接种鲜血琼脂斜面37℃培养24 h，4℃保存。

1.2.2 致病性试验

将分离菌接种到营养肉汤中，37℃震荡培养18 h。每株菌接种3只小白鼠，于小鼠腿部肌肉注射肉汤纯培养物0.2 ml/只，对照组小白鼠注射灭菌肉汤 0.2 ml/只。观察并记录小白鼠发病及死亡情况，对发病死亡的小白鼠进行剖解，观察病变，取其病料进行细菌分离培养。

1.2.3 生化试验

取分离菌肉汤培养物进行葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖的发酵试验，同时进行吲哚、MR、VP、柠檬酸盐利用试验和硫化氢试验。将细菌分别接种到相应的微量发酵管中，置37℃培养。糖发酵试验在24h观察结果，其他生化试验在48～72 h内观察结果[2]。

1.2.4 药敏试验

无菌条件下取细菌纯培养物密集划线接种于整个营养琼脂平板，将药敏片均匀贴放到平板上，每个平板5片。将平板倒置于37℃培养24 h，观察药物的抑菌情况，测定各种药物抑菌圈的大小[3]。

2 试验结果

2.1 培养特性及镜检

从37份病料中共分离出21株细菌。所分离的细菌在普通肉汤中均生长良好，均匀混浊，管底有灰白色沉淀，轻摇呈云雾状；在普通琼脂平板为灰白色、半透明、表面隆起、光滑圆润、边缘整齐的菌落；在麦康凯琼脂培养基上生长出周围粉红色，中心深红色的菌落。染色显示，分离菌为两端钝圆、中等大小、革兰氏阴性小杆菌，多呈单个散在排列。

2.2 生化试验

所分离的细菌均能能够发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和甘露醇，产酸产气；能发酵蔗糖，不产气；吲哚和MR试验阳性；VP试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验和尿素分解试验为阴性。结合培养特性及镜检结果，均鉴定为大肠杆菌。

2.3 药物敏感试验结果

药敏试验结果表明，16株鸡源致病性大肠杆菌均对菌必治（头孢曲松）敏感，对丁胺卡那霉素（阿米卡星）、先锋噻肟、氨曲南和复达欣（头孢他啶）4种药物也具有较高的敏感性，分别为87.5%、87.5%、81.3%和75%。对呋喃妥因、庆大霉素、头孢呋辛、链霉素、氟哌酸（诺氟沙星）、利福平等表现出不同程度的耐药性，而对环丙沙星、克拉霉素、万古霉素和红霉素完全耐药（见表1）。

3 分析讨论

3.1 大肠杆菌产生耐药性的原因

大肠杆菌是动物体内的常在细菌，是一种重要的条件性致病菌，凡能引起机体抵抗力降低的各种因素，均可诱发大肠杆菌病。抗生素和化学药物在防控大肠杆菌病中发挥了十分关键的作用。由于在生产中不合理的使用药物来预防和治疗大肠杆菌病，使得大肠杆菌耐药性日益严重。临床上不合理用药包括：（1）不能在正确诊断疾病的基础上用药；（2）不进行药敏试验以选择敏感的抗菌药物；（3）不注意药物的剂量、疗程和用药时机；（4）过早使用二线药物预防；（5）不注意穿梭用药和轮换用药，长期倾向于使用特定的一种或几种药物[3]。

3.2 安丘地区鸡源大肠杆菌耐药情况

本试验发现，安丘地区鸡源大肠杆菌对第三代头孢类抗生素菌必治（头孢曲松）、先锋噻肟（头孢噻肟）和复达欣（头孢他啶）具有很好的敏感性，其中，对菌必治（头孢曲松）的敏感率达100%，因此，在临床病例治疗中可以适当选用。然而分离菌对第一、二代头孢类抗生素头孢唑啉和头孢呋辛表现出较强的耐药性，这可能与这两类抗生素在临床预防和治疗中广泛应用直接相关。此外，丁胺卡那霉素（阿米卡星）对鸡源致病性大肠杆菌也具有良好的抑杀效果。本研究还发现，安丘地区鸡源大肠杆菌对氨曲南的敏感性亦达81.3%，这可能与该药在兽医领域尚未广泛使用有关。本试验调查结果表明，所分离的鸡源致病性大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星均表现出了极高的耐药性，这可能是因为细菌对喹诺酮类药物的耐药机制一致，细菌对常用药物环丙沙星产生耐受性后，必将引起对同类其他药物的耐受性[4]。利福平是治疗结核病的重要药物之一，由于在禽病防控中违规使用该药，鸡源大肠杆菌对利福平也表现出极高的耐药率，这与李晓柳等报道的山东地区鸡源大肠杆菌耐药性情况相似，然而对其他药物如卡那霉素、氨曲南的药敏结果却差异较大，这可能与不同区域及不同养鸡场分离的菌株差异有关。