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松脂皱皮孔菌发酵液化学成分的研究

2015-01-25吴培云陆云德刘吉开

中成药 2015年10期
关键词:松脂麦角三氯甲烷

吴培云, 陆云德,, 刘吉开, 王 刚*

(1. 安徽中医药大学药学院,现代中药安徽省重点实验室,安徽 合肥230012;2. 中国科学院昆明植物研究所,云南昆明650201)

松脂皱皮孔菌Ischnoderma resinosum 属于多孔菌科皱皮菌属高等真菌,子实体大,主要分布在黑龙江、吉林、河北、广西、云南、陕西、四川、西藏等地。另外,该菌亦可食用,能引起针叶或阔叶树木材白色腐朽,而且朽材松软,常出现白色绢丝状斑纹。文献[1]报道,松脂皱皮孔菌具有抗癌活性,对肉瘤S-180 的抑制率为70%,而对艾氏癌的抑制率为80%。

高等真菌属于“创造系数”很高的生物资源[2],含有大量结构新颖和生物活性显著的次生代谢产物,目前人们已从中发现了许多生物活性很高的先导母体化合物,其中有不少种类易于发酵培养。其应用于代谢产物生产时具有很多优点,能克服化学合成中可能存在的不经济性,而且发酵培养具有可通过筛选来获得高产菌种、容易控制培养条件、产物质量可靠、易于大规模生产等优点[3]。目前,尚未发现有关松脂皱皮孔菌化学成分的研究报道,为了从该真菌中寻找活性成分,本实验对其发酵液进行了系统的化学成分研究,结果从中分离出了10 个化合物,分别鉴定为rosenonolactone(1)、2-nonyne-1,4-diol (2)、1-hydroxy-2-nonyn-4-one (3)、过氧麦角甾醇(4)、麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮(5)、麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇(6)、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(7)、anti-1-(4-methoxyphenyl)proane-1,2-diol(8)、syn-1- (4-methoxyphenyl) proane-1,2-diol(9)、1-phenylpropane-1,2-diol (10)。而且,所有化合物均为首次从松脂皱皮孔菌中分离得到。

1 实验方法

1.1 材料及仪器 Bruker AV-400、AVANCE Ⅲ-500、600 核磁共振仪,内标为TMS (德国Bruker公司);VG AutoSpec-3000 质谱仪 (英国VG 公司);薄层层析、柱层析硅胶(青岛海洋化工有限公司);Agilent 1100 HPLC 色谱仪、Agilent Zorbax SB-C18色谱柱 (美国Agilent Technologies 公司);YMC 色谱柱(日本YMC 公司);Lichroprep Rp-18反相硅胶(40 ~63 μm,德国Merck 公司);Sephadex LH-20 凝胶 (瑞典Amersham Biosciences 公司)。乙腈、甲醇均为色谱纯(天津市大茂化学试剂厂);氯仿、甲醇、石油醚、乙酸乙酯均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

松脂皱皮孔菌于2006 年8 月采自吉林长白山国家级自然保护区,由北京林业大学戴玉成教授鉴定为多孔菌科皱皮菌属高等真菌松脂皱皮孔菌Ischnoderma resinosum,标本保存于中国科学院昆明植物研究所标本馆。

1.2 发酵与培养 根据昆明植物研究所李正辉工程师采用的斜面转摇瓶液体培养方法[4],对该菌种进行发酵培养。其中,培养基为5% 葡萄糖,0.1%猪肉蛋白胨,0.5%酵母粉,0.05% KH2PO4和MgSO4,25 ℃下摇床发酵25 d,转速为160 ~165 r/min,装液量350 mL,发酵液总量20 L。

1.3 提取分离 取松脂皱皮孔菌Ischnoderma resinosum 发酵液20 L,乙酸乙酯萃取3 次后合并,减压浓缩,得到18 g 粗提物。然后,经硅胶柱色谱,三氯甲烷-甲醇(100 ∶0→0 ∶100)梯度洗脱,得到7 个组分(A、B、C、D、E、F、G)。

组分C (三氯甲烷∶甲醇=100 ∶2)经中压反相RP-18 柱色谱,甲醇-水(30 ∶70→100 ∶0)梯度洗脱,得到13 个亚组分(C1~C13)。其中,C3经硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯(5 ∶1)洗脱,再经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脱,得到化合物10 (3.9 mg);C4经硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯(12 ∶1→5 ∶1)梯度洗脱,再经反相HPLC 制备柱色谱,乙腈-水(0 ∶100 →30 ∶70)梯度洗脱,得到化合物8(110.5 mg)和9 (52.3 mg);C8经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脱,再经反相RP-18 柱色谱,甲醇-水(30 ∶70→40 ∶60)梯度洗脱,得到化合物2 (23.4 mg);C9经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷∶甲醇(1 ∶1)洗脱,再经硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯(8 ∶1)洗脱,得到化合物3 (2.1 mg);C10经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脱,再经硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯(15 ∶1)洗脱,得到化合物1 (13.1 mg);C11经硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯(10 ∶1)洗脱,再经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脱,得到化合物5(7.2 mg);C12经Sephadex LH-20 柱色谱,三氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脱,再经重结晶后得到化合物4 (3.8 mg)和6 (2.6 mg);C13经重结晶后,得到化合物7 (3.3 mg)。

2 结果与讨论

化合物1:白色针晶,ESI-MS m/z 339 [M +Na]+。1H-NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.81 (1H,dd,J =17.5,10.7 Hz,H-15),4.98 (1H,d,J =17.5 Hz,H-16),4.91 (1H,d,J =10.7 Hz,H-16),2.41 (1H,m,H-8),2.40 (1H,m,H-6β),2.27 (1H,m,H-1),2.26 (1H,m,H-5),2.13(1H,m,H-6α),1.96 (1H,m,H-2β),1.93(1H,m,H-11β),1.77 (1H,m,H-3β),1.76(1H,m,H-2α),1.67 (1H,m,H-11α),1.59(1H,m,H-3α),1.51 (2H,m,H-12),1.32 (1H,m,H-14),1.12 (3H,s,H-18),0.96 (3H,s,H-17),0.94 (3H,s,H-20)。13C-NMR (CDCl3,100 MHz)δ:210.3 (C-7),179.3 (C-19),149.5 (C-15),109.9 (C-16),86.9 (C-10),50.9 (C-5),47.3 (C-8),47.2 (C-4),38.8 (C-9),35.8 (C-6),35.4 (C-3),35.0 (C-13),31.6 (C-14),31.4(C-12),30.7 (C-11),30.2 (C-1),21.8 (C-17),19.8 (C-2),16.9 (C-18),16.8 (C-20)。以上数据与文献[5] 报道基本一致,确定该化合物为rosenonolactone。

化合物2:无色油状物,ESI-MS m/z 179 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,500 MHz)δ:4.38 (1H,t,J =6.5 Hz,H-4),4.28 (2H,brs,H-1),1.66(2H,m,H-5),1.42 (2H,m,H-6),1.29 (4H,m,H-7,8),0.88 (3H,t ,J =6.9 Hz,H-9)。13CNMR (CDCl3,125 MHz)δ:86.7 (C-3),82.9 (C-2),62.2 (C-4),50.6 (C-1),37.5 (C-5),31.4(C-7),24.9 (C-6),22.5 (C-8),14.0 (C-9)。以上数据与文献[6]报道基本一致,确定该化合物为2-nonyne-1,4-diol。

化合物3:无色油状物,ESI-MS m/z 177 [M+Na]+。1H-NMR (CDCl3,600 MHz)δ:4.44 (2H,brs,H-1),2.56 (2H,t,J =7.2 Hz,H-5),1.67(2H,m,H-6),1.31 (2H,m,H-8),1.29 (2H,m,H-7),0.89 (3H,t,J =7.2 Hz,H-9)。13CNMR (CDCl3,150 MHz)δ:180.0 (C-4),89.4 (C-3),84.8 (C-3),51.1 (C-1),45.5 (C-5),31.3(C-7),23.7 (C-6),22.5 (C-8),14.1 (C-9)。以上数据与文献[7]报道基本一致,确定该化合物为1-hydroxy-2-nonyn-4-one。

化合物4:无色针晶。其TLC 的Rf值及显色行为均与过氧麦角甾醇对照品一致,而且与对照品混合时熔点不下降,确定该化合物为过氧麦角甾醇。

化合物 5:无色针晶,EI-MS m/z 392[M]+。1H-NMR (CDCl3,400 MHz)δ:6.56 (1H,d,J=9.4 Hz,H-7),6.02 (1H,d,J=9.4 Hz,H-6),5.71 (1H,s,H-4),5.24 (1H,dd,J =15.2,7.2 Hz,H-23),5.18 (1H,dd,J =15.2,7.2 Hz,H-22),1.03 (3H,d,J = 6.6 Hz,H-21),0.97(3H,s,H-19),0.93 (3H,s,H-18),0.90 (3H,d,J =6.8 Hz,H-28),0.82 (3H,d,J =6.8 Hz,H-27),0.77 (3H,d,J=6.6 Hz,H -26)。以上数据与文献[8]报道基本一致,确定该化合物为麦角甾-4,6,8 (14),22-四烯-3-酮。

化合物 6:无色针晶,EI-MS m/z 396[M]+。1H-NMR (CDCl3,400 MHz)δ:5.57 (1H,m,H-6),5.38 (1H,m,H-7),5.22 (1H,m,H-23),5.16 (1H,m,H-22),3.62 (1H,m,H-3),1.04 (3H,d,J=6.6 Hz,H-21),0.97 (3H,s,H-19),0.92 (3H,d,J=6.6 Hz,H-28),0.84 (3H,d,J =6.6 Hz,H-27),0.82 (3H,d,J =6.6 Hz,H-26),0.63 (3H,s,H-18)。以上数据与文献[9]报道基本一致,确定该化合物为麦角甾-5,7,22-三烯-3β-醇。

化合物 7:无色针晶,EI-MS m/z 430[M]+。1H-NMR (C5D5N,400 MHz)δ:5.74 (1H,m,H-7),5.24 (1H,m,H-23),5.16 (1H,m,H-22),4.82 (1H,m,H-13),4.30 (1H,brs,J=4.8 Hz,H-6),1.52 (3H,s,H-19),1.06 (3H,d,J=6.4 Hz,H-21),0.93 (3H,d,J =6.8 Hz,H-28),0.83 (3H,d,J =6.7 Hz,H-27),0.83 (3H,d,J=6.7 Hz,H-26),0.66 (3H,s,H-18)。以上数据与文献[10] 报道基本一致,确定该化合物为麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇。

化合物 8:无色针晶,EI-MS m/z 182[M]+。1H-NMR (CD3OD,400MHz)δ:7.27 (2H,dd,J =8.7,2.6 Hz,H-2',6'),6.87 (2H,dd,J =8.7,2.6 Hz,H-3',5'),4.43 (1H,d,J =5.2 Hz,H-1),3.83 (1H,m,H-2),3.76 (3H,s,-OCH3),1.11 (3H,d,J = 6.3 Hz,H-3)。13CNMR (CD3OD,100 MHz)δ:160.4 (C-4'),135.3(C-1'),129.2 (C-2',6'),114.4 (C-3',5'),78.7(C-1),72.4 (C-2),55.7 (-OCH3),18.4 (C-3)。以上数据与文献[11] 报道基本一致,确定该化合物为anti-1-(4-methoxyphenyl)proane-1,2-diol。

化合物 9:无色针晶,EI-MS m/z 182[M]+。1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ:7.25 (2H,dd,J =8.6,2.6 Hz,H-2',6'),6.88 (2H,dd,J=8.6,2.6Hz,H-3',5'),4.28 (1H,d,J =7.3 Hz,H-1),3.78 (1H,m,H-2),3.75 (3H,s,-OCH3),0.93 (3H,d,J=6.4 Hz,H-3)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:160.7 (C-4'),135.3 (C-1'),129.4 (C-2',6'),114.6 (C-3',5'),79.9(C-1),73.0 (C-2),55.7 (-OCH3),19.3 (C-3)。以上数据与文献[11] 报道基本一致,确定该化合物为syn-1- (4-methoxyphenyl)proane-1,2-diol。

化合物10:无色针晶。其TLC 的Rf值及显色行为均与1-phenylpropane-1,2-diol 对照品一致,而且两者混合时熔点不下降,确定该化合物为1-phenylpropane-1,2-diol。

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