通过环磷酸腺苷信号通路治疗焦虑症的研究进展

朱春辉（宁波市镇海龙赛医院药剂科，浙江宁波 315200）

焦虑症以持续性紧张、担心、恐惧或发作性惊恐为特征，伴有自主神经系统症状和运动不安等行为，常可导致严重的功能障碍，其研究机制主要集中在神经递质及相应受体方面，具体的细胞内信号通路尚未被明确[1]。越来越多的行为学和药理学研究显示，焦虑的调节是通过细胞内第二信使环磷酸腺苷（cAMP）进行的，且cAMP的产生及转化受各种酶类的影响。本文拟以“Anxiety”“Cyclic adenosine monophosphate”“Adenylate cyclase”“Phosphodiesterase”“Protein kinase A”等为关键词，组 合 检 索2000－2014 年PubMed、ScienceDirect、Springer 等数据库的相关文献。结果共查阅到文献236 篇，其中有效文献33篇。现就近年来国内外通过第二信使cAMP通路治疗焦虑症的相关研究进展进行综述。

1 腺苷酸环化酶

腺苷酸环化酶（AC）能够将三磷酸腺苷（ATP）转变成cAMP，引起细胞的信号应答。传统cAMP信号通路研究目标主要集中于细胞膜受体，近年来也有以AC为靶目标的研究报道[2]。哺乳动物中已发现9 种AC 跨膜亚型（AC1～AC9）[3]。AC主要分两类：一种是被钙离子（Ca2+）/钙调蛋白激活，主要分布于脑组织；另一种由鸟苷酸结合蛋白即G 蛋白家族中的Gs蛋白介导，这类AC 分布广泛，且活性能被G 蛋白家族中的Gi蛋白抑制。

1.1 Ca2+调节的AC

Ca2+调节的AC亚型是cAMP和神经元活动的重要组成部分，主要与精神疾病相关[4]。Ca2+刺激的AC 亚型包括AC1 和AC8，海马齿状回和大脑皮层中含有丰富的AC1，下丘脑中则富含AC8。Ca2+浓度抑制的AC 亚型为AC5，主要在纹状体中表达[5]。

Schaefer ML 等[6]通过胚胎干细胞同源重组技术培育的AC8基因敲除小鼠，其脑部海马、丘脑、脑干等部位Ca2+刺激的AC活性下降，高架十字迷宫（EPM）和旷场（Open field）实验显示，基因敲除小鼠能调节重复应激所导致的焦虑。研究显示，AC8 基因敲除小鼠的海马CA1 区长时程抑制（LTD）损害，且该脑区压力诱导的cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）转录因子的磷酸化作用减弱，导致海马依赖的认知缺陷，应对压力时的焦虑减少[7]。Krishnan V等[8]用新异环境测试AC5基因敲除和AC1/8 双基因敲除小鼠的自主活动性，发现两者呈相反趋势，雄性AC5基因敲除小鼠较正常小鼠的自主活动性高，且在高架开臂区的活动时间及明暗箱中光亮区域活动时间明显增加，而AC1/8双基因敲除小鼠在这几项指标上均未见有显著性差异，表明AC5基因敲除小鼠有明显的抗焦虑样作用。

以上研究结果表明，AC5基因与焦虑密切相关，AC8基因与长期应激导致的焦虑有关。敲除小鼠Ca2+调节的AC基因显示了较强的抗焦虑作用，提示抗焦虑样作用可能与Ca2+调节的AC活性下降有关，推测细胞内cAMP水平可能呈下降趋势。

1.2 G蛋白调节的AC

现已发现，除心房钠尿肽（ANP）受体外，所有已克隆的神经肽受体都属于G蛋白偶联受体。促肾上腺皮质激素释放因子/激素（CRF/CRH）在下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴中起神经调质作用，与焦虑、压力调节有密切关系，杏仁核是其主要表达位点之一[9]。CRF 系统长期过度活跃会导致诸如焦虑等与压力相关的情绪紊乱[10]。

小鼠体内已发现CRH1 和CRH2 两种受体，其中CRH1 受体在垂体前叶、新皮层、海马、杏仁核等脑区高度表达。研究发现，Crhr1（loxP/loxP）Camk2a-cre 基因敲除小鼠的CRH1 受体功能缺失能增强小鼠探寻活动且减少焦虑相关行为[11]。CRH1/CRF1受体是Gs蛋白偶联受体，在HEK293细胞内高度表达，通过作用于AC生成cAMP，并激活蛋白激酶A（PKA）[12]。Gilligan PJ等[13]发现，DMP904能拮抗HEK293细胞中CRF1受体偶联的AC活性，在最小口服有效剂量（0.3 mg/kg）下就能观察到最大药效，提示DMP904可能成为一个副作用更低的新型抗焦虑药。

松弛肽受体（RXFPs）是G 蛋白偶联受体，RXFP3 mRNA在人脑黑质、垂体、海马、杏仁核等中枢神经系统中高度表达[14]。RXFP3 激动药Relaxin-3 类似神经递质能被释放至突触间隙，从而参与应激反应的调节。大鼠束缚应激时第四脑室附近的脑桥背盖中央灰质中Relaxin-3 mRNA 表达增加，进一步研究发现，约70%表达Relaxin-3的神经元通过侧脑室的CRF 来诱导即早基因（c-Fos）表达，提示表达Relaxin-3 的神经元可能是通过CRF1受体来调节压力[15]。RXFP3拮抗药INSL5能抑制大鼠脑内的AC活性进而抑制cAMP积聚。这种抑制作用是通过Gi/o蛋白产生，提示Relaxin-3/RXFP3系统可能是体内调节压力和焦虑的重要系统，RXFP3可能成为抗焦虑药的潜在靶点[16]。

有文献报道，5-羟色胺（5-HT）1A 受体激动药在各种经典焦虑行为实验如Vogel饮水冲突、Gellar-Seifter冲突、EPM等实验中显示抗焦虑样作用，而拮抗药能阻滞这种作用。CSP-2503是5-HT1受体激动药，能减少小鼠下丘脑5-HT神经元的活性及大鼠中缝核细胞的电生理活性，阻滞毛喉素增强的人5-HT1A 受体转染海拉细胞的AC 活性，大鼠明暗箱和社会交互实验显示抗焦虑样作用[17]。研究显示，5-HT1A 受体与Gi/o 蛋白偶联，激活后能抑制AC 活性[18]。因此，5-HT1A 受体激动药能减少cAMP的形成，抑制PKA介导的磷酸化[19]。Dell’Osso L 等[20]研究22 位健康人和22 位焦虑惊恐障碍患者时发现，焦虑惊恐障碍患者血小板中的5-HT 抑制AC 能力显著减弱，通过给予帕罗西汀1个月治疗后发现接近正常水平。研究提示患者血小板中5-HT抑制AC的能力减弱，且5-HT响应能力减弱与其受体偶联的G蛋白能力减弱有关。

Bellido I 等[21]证实，大鼠5-HT 神经元上的甘丙肽可调节5-HT 递质传递，并缓解焦虑相关神经障碍。中缝背核（DRN）中5-HT 神经元的活性主要是通过5-HT1A 自受体抑制AC 活性和激活内流的K+离子通道调节，甘丙肽受体1（GalR1）信号通过机制完全相同，其调节大鼠中缝背核5-HT神经元活性通过GalR1 受体/自受体进行[22]。甘丙肽受体1 也是G 蛋白偶联受体，激活后通过Gi 蛋白抑制AC 活性，降低cAMP 水平。甘丙肽受体3基因敲除小鼠也表现出焦虑症状[23]。

P 物质（SP）及其受体NK1 选择性激动药SarMet-SP 注射到小鼠内侧核和中央核中，EPM 实验显示出焦虑样作用[24]。正常小鼠EPM 实验显示，NK1 受体拮抗药RP67580 具有抗焦虑样作用，对NK1 受体基因敲除小鼠无明显作用[25]。这些研究提示，P物质NK1受体可能参与了焦虑的形成，该受体可能成为抗焦虑药研制的另一潜在靶点。

CRF1/CRH1 受体和RXFP3 拮抗药均能抑制AC 活性，产生抗焦虑样作用，推测与胞内cAMP 水平下降相关。甘丙肽、SP 等激动药或拮抗药的抗焦虑作用可能是通过激动5-HT1A受体、抑制AC、降低cAMP 水平产生。综合这些研究发现，神经肽受体因其与G 蛋白偶联，故而与AC 的活性密切相关，可能成为抗焦虑药研究的新靶点。

2 磷酸二酯酶

磷酸二酯酶（PDE）具有降解细胞内cAMP 或环磷酸鸟苷（cGMP）的功能，从而终结这些第二信使所转导的生化作用。咯利普兰是PDE4 专属性抑制剂。Li YF 等[26]研究发现，小鼠长期腹腔注射咯利普兰能增加海马和前额皮层的cAMP 和cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化作用（pCREB）水平，增加溴脱氧尿苷（BrdU）阳性细胞在海马齿状回的表达，产生抗抑郁和抗焦虑样作用；而对增生细胞有毒性的甲基氧化偶氮甲醇（MAM）能逆转这种作用，并部分阻滞咯利普兰的抗焦虑作用；停止给予MAM后咯利普兰又能增加海马的pCREB，重新表现抗抑郁和抗焦虑样作用。也有研究发现，PDE4 抑制剂GSK356278 可能会是一种比咯利普兰更优秀的药物，能有效治疗焦虑症和改善大脑认知的功能[27]。

这些研究结果表明，PDE4抑制剂抗焦虑作用至少部分是通过海马的神经性活动增加细胞内cAMP水平来实现的。

3 cAMP依赖的蛋白激酶A

一般认为，cAMP的生理功能是通过cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）来介导的，PKA 激活后促使靶蛋白磷酸化产生效应。最近也有研究发现，cAMP通过环磷酸腺苷活化的交换蛋白（Epac）激活有丝分裂激酶（MAPK）信号转导通路产生作用。

Tardito D 等[28]采用Western Blot、免疫染色和计算机辅助成像技术研究惊恐障碍（PD）和PKA信号的关系，分析了24例PD患者和24例健康志愿者的PKA调节亚单位R（RⅠ、RⅡ）、催化亚单位C和Rap1蛋白的水平，结果发现PD患者血小板中RⅠ和C亚基水平明显高于正常组，RⅡ亚基水平未见改变，免疫标记Rap1 两组未见显著差异。Rap1 蛋白属于小分子G 蛋白Ras家族，主要通过其效应子影响胞外信号调节激酶（ERK）通路，即Ras/MAPK信号通路来介导跨膜信息传递。这一研究表明与焦虑症有关的可能是cAMP信号途径而非MAPK信号转导通路。

β3 肾上腺素受体（β3-AR）是Gs 蛋白偶联受体，在靶细胞通过cAMP-PKA信号级联产生作用[29]。传统观点认为，β肾上腺素受体激动与焦虑有关；最近研究发现，选择性激动β3-AR能产生与地西泮相似水平的抗焦虑作用[30]。β3-AR 激动药BRL37344 能增强基底外侧杏仁核中LPCS（Lateral Paracapsular）细胞γ-氨基丁酸（GABA）能突触的抑制性突触后电流（eIPSCs）。Silberman Y 等[31]采用全细胞膜片钳技术在电极液中加入PKA拮抗药Rp-cAMPS，胞内透析能阻滞这种作用，提示β3-AR 对LPCS 细胞GABA 能突触抑制性增强作用依赖cAMP机制介导。

Misra K 等[32]研究酒精摄入和焦虑样行为大鼠的伏核（NAc）PKA信号通路时发现，在伏核壳注射Rp-cAMP，EPM实验并未发现对焦虑样行为的调节作用。降低大鼠伏核壳的PKA功能可能与焦虑行为无关。而Pandey SC等[33]研究发现，酒精偏好大鼠具有更高的基线焦虑水平，在中央杏仁核（CeA）注射PKA 激动药Sp-cAMP 可减少其酒精摄入和焦虑样行为，同时增加CeA中CREB表达；而在非酒精偏好的大鼠CeA注射PKA抑制剂Rp-cAMP，会激发焦虑样行为和增加大鼠的酒精摄入。

综上，PKA 激动药产生抗焦虑行为可能与某些脑区相关。与AC研究不同的是，PKA激动药产生抗焦虑作用是增加了某些脑区的cAMP水平，与PDEs抑制剂类似。

4 结语

焦虑症的发病机制目前尚不清楚，其递质假说也未被完全揭示，细胞内第二信使的研究比较零散。笔者针对其中一条胞内信号途径——cAMP途径查阅文献，发现抗焦虑作用实验研究的靶点主要侧重于AC；主要采取基因敲除技术、受体激动药或拮抗药阻滞cAMP信号转导的方法。到目前为止，焦虑症产生的胞内信号途径还未被明确，且研究部位的各种神经元之间cAMP 水平存在一定差异，但从研究情况来看，似乎也能推测出一些规律，如5-HT1A受体激动药的抗焦虑作用可能是通过抑制AC、降低胞内cAMP水平而产生的，某些神经肽类受体激动药或拮抗药的抗焦虑作用也可能通过此途径产生。PDEs 抑制剂和PKA 激动药的抗焦虑作用则可能是通过增加特定脑区内的cAMP水平来实现的。随着研究深入，焦虑症的第二信使途径也正逐渐引起重视，希望其研究的深入开展有助于早日攻克焦虑症。

[1]Favilla C，Abel T，Kelly MP.Chronic Galphas signaling in the striatum increases anxiety-related behaviors independent of developmental effects[J].J Neurosci，2008，28（51）：13 952.

[2]Pavan B，Biondi C，Dalpiaz A.Adenylyl cyclases as innovative therapeutic goals[J].Drug Discov Today，2009，14（19/20）：982.

[3]Bernatchez R，Belkacemi L，Rassart E，et al.Differential expression of membrane and soluble adenylyl cyclase isoforms in cytotrophoblast cells and syncytiotrophoblasts of human placenta[J].Placenta，2003，24（6）：648.

[4]Wang H，Storm DR.Calmodulin-regulated adenylyl cyclases：cross-talk and plasticity in the central nervous system[J].Mol Pharmacol，2003，63（3）：463.

[5]Conti AC，Maas JW Jr，Muglia LM，et al.Distinct regional and subcellular localization of adenylyl cyclases type 1 and 8 in mouse brain[J].Neuroscience，2007，146（2）：713.

[6]Schaefer ML，Wong ST，Wozniak DF，et al.Altered stressinduced anxiety in adenylyl cyclase type Ⅷ-deficient mice[J].J Neurosci，2000，20（13）：4 809.

[7]Zhang M，Moon C，Chan GC，et al.Ca-stimulated type 8 adenylyl cyclase is required for rapid acquisition of novel spatial information and forworking/episodic-like memory[J].J Neurosci，2008，28（18）：4 736.

[8]Krishnan V，Graham A，Mazei-Robison MS，et al.Calcium-sensitive adenylyl cyclases in depression and anxiety：behavioral and biochemical consequences of isoform targeting[J].Biol Psychiatry，2008，64（4）：336.

[9]Ji G，Neugebauer V.Pro-and anti-nociceptive effects ofcorticotropin-releasing factor（CRF）in central amygdala neurons are mediated through different receptors[J].J Neurophysiol，2008，99（3）：1 201.

[10]Elliott E，Ezra-Nevo G，Regev L，et al.Resilience to social stress coincides with functional DNA methylation of the Crf gene in adult mice[J].Nat Neurosci，2010，13（11）：1 351.

[11]Müller MB，Zimmermann S，Sillaber I，et al.Limbic corticotropin-releasing hormone receptor 1 mediates anxiety-related behavior and hormonal adaptation to stress[J].Nat Neurosci，2003，6（10）：1 100.

[12]Hillhouse EW，Grammatopoulos DK.The molecular mechanisms underlying the regulation of the biological activity of corticotropin-releasing hormone receptors：implications for physiology and pathophysiology[J].Endocr Rev，2006，27（3）：260.

[13]Gilligan PJ，Baldauf C，Cocuzza A，et al.The discovery of 4-（3-pentylamino）-2，7-dimethyl-8-（2-methyl-4-methoxyphenyl）-pyrazolo-[1，5-a]-pyrimidine：a corticotropin-releasing factor（hCRF1）antagonist[J].Bioorg Med Chem，2000，8（1）：181.

[14]Liu C，Eriste E，Sutton S，et al.Identification of relaxin-3/INSL7 as an endogenous ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPCR135[J].J Biol Chem，2003，278（50）：50 754.

[15]Tanaka M，Iijima N，Miyamoto Y，et al.Neurons expressing relaxin 3/INSL 7 in the nucleus incertus respond to stress[J].Eur J Neurosci，2005，21（6）：1 659.

[16]van der Westhuizen ET，Halls ML，Samuel CS，et al.Relaxin family peptide receptors：from orphans to therapeutic targets[J].Drug Discov Today，2008，13（15/16）：640.

[17]Delgado M，Caicoya AG，Greciano V，et al.Anxiolytic-like effect of a serotonergic ligand with high affinity for 5-HT1A，5-HT2A and 5-HT3 receptors[J].Eur J Pharmacol，2005，511（1）：9.

[18]Pucadyil TJ，Kalipatnapu S，Chattopadhyay A.The serotonin1A receptor：a representative member of the serotonin receptor family[J].Cell Mol Neurobiol，2005，25（3/4）：553.

[19]Ohno Y.New insight into the therapeutic role of 5-HT1A receptors in central nervous system disorders[J].Cent Nerv Syst Agents Med Chem，2010，10（2）：148.

[20]Dell’Osso L，Carmassi C，Palego L，et al.Serotonin-mediated cyclic AMP inhibitory pathway in platelets of patients affected by panic disorder[J].Neuropsychobiology，2004，50（1）：28.

[21]Bellido I，Díaz-Cabiale Z，Jiménez-Vasquez PA，et al.Increased density of galanin binding sites in the dorsal raphe in a genetic rat model of depression[J].Neurosci Lett，2002，317（2）：101.

[22]Larm JA，Shen PJ，Gundlach AL.Differential galanin receptor-1 and galanin expression by 5-HT neurons in dorsal raphé nucleus of rat and mouse：evidence for species-dependent modulation of serotonin transmission[J].Eur J Neurosci，2003，17（3）：481.

[23]Brunner SM，Farzi A，Locker F，et al.GAL3 receptor KO mice exhibit an anxiety-like phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（19）：7 138.

[24]Bassi GS，de Carvalho MC，Brandão ML.Effects of substance P and Sar-Met-SP，a NK1 agonist，in distinct amygdaloid nuclei on anxiety-like behavior in rats[J].Neurosci Lett，2014，569（4）：121.

[25]Santarelli L，Gobbi G，Debs PC，et al.Genetic and pharmacological disruption of neurokinin 1 receptor function decreases anxiety-related behaviors and increases serotonergic function[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（4）：1 912.

[26]Li YF，Huang Y，Amsdell SL，et al.Antidepressant-and anxiolytic-like effects of the phosphodiesterase-4 inhibitor rolipram on behavior depend on cyclic AMP response element binding protein-mediated neurogenesis in the hippocampus[J].Neuropsychopharmacology，2009，34（11）：2 404.

[27]Rutter AR，Poffe A，Cavallini P，et al.GSK356278，a potent，selective，brain-penetrant phosphodiesterase 4 inhibitor that demonstrates anxiolytic and cognition-enhancing effects without inducing side effects in preclinical species[J].J Pharmacol Exp Ther，2014，350（1）：153.

[28]Tardito D，Zanardi R，Racagni G，et al.The protein kinase A in platelets from patients with panic disorder[J].Eur Neuropsychopharmacol，2002，12（5）：483.

[29]Vrydag W，Michel MC.Tools to study beta3-adrenoceptors[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2007，374（5/6）：385.

[30]Stemmelin J，Cohen C，Terranova JP，et al.Stimulation of the beta3-adrenoceptor as a novel treatment strategy for anxiety and depressive disorders[J].Neuropsychopharmacology，2008，33（3）：574.

[31]Silberman Y，Ariwodola OJ，Chappell AM，et al.Lateral paracapsular GABAergic synapses in the basolateral amygdala contribute to the anxiolytic effects of beta 3 adrenoceptor activation[J].Neuropsychopharmacology，2010，35（9）：1 886.

[32]Misra K，Pandey SC.The decreased cyclic-AMP dependent-protein kinase A function in the nucleus accumbens：a role in alcohol drinking but not in anxiety-like behaviors in rats[J].Neuropsychopharmacology，2006，31（7）：1 406.

[33]Pandey SC，Zhang H，Roy A，et al.Deficits in amygdaloid cAMP-responsive element-binding protein signaling play a role in genetic predisposition to anxiety and alcoholism[J].J Clin Invest，2005，115（10）：2 762.