基因工程在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的应用

基因工程在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的应用

王曼李树仁

(河北医科大学附属河北省人民医院，河北石家庄050051)

关键词〔〕基因工程；充质干细胞；心肌梗死

中图分类号〔〕R54〔

通讯作者：李树仁(1964-)，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事冠心病介入及心力衰竭研究。

第一作者：王曼(1987-)，女，在读硕士，主要从事心血管病学研究。

随着溶栓和急诊冠脉介入的广泛开展，急性心肌梗死(AMI)的死亡率明显降低。但是心肌梗死后心室重构以及缺血性心肌病的发生严重影响了患者的预后。要使心肌细胞再生乃至衰竭的心脏恢复功能仍是一项巨大的挑战。研究提示骨髓间充质干细胞(BMSCs)可参与受损心肌的重建，可以提高左室射血分数，降低左心室收缩末期和舒张末期容积、减少梗死面积并改善左室重构〔1〕。但是BMSCs在梗死心肌中的长期存活仍未能解决。心肌梗死后微环境的改变限制了干细胞的修复能力，人们正在利用BMSCs基因工程的方法来解决这一问题。基因工程是将外源性基因导入目的细胞中，使得该细胞具备过表达或静默表达某种基因的能力。本文阐述基因工程在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的应用。

1基因导入系统

基因导入系统是基因治疗的核心技术，有物理、化学、生物三类方法，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统，按基因表达时限可分为瞬时表达系统和永久表达系统。应根据需要借助不同的方法。物理法包括电穿孔法、基因枪粒子轰击法和显微注射法等。物理法虽操作简便，但效率低。化学法包括磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子多聚物(多聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，树突状聚合物)、壳聚糖载体聚合物和无机纳米粒子载体等。生物法主要指病毒载体，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体等。

2MSCs治疗心肌梗死的机制

MSCs存在于多种成体组织内，骨髓是MSCs的主要来源。MSCs可分化为包括骨、软骨、肌肉、脂肪、肝脏、肾脏、内皮、神经元、心肌等在内的多个细胞谱系。自体和异体的MSC都被证明能够参与组织再生。MSCs移植改善梗死后心脏功能的机制主要包括以下两点：①MSCs可分泌多种因子，促进细胞增殖与血管再生建立侧支循环，抑制梗死区扩大与心肌细胞凋亡〔2〕；②MSCs能表达肌钙蛋白-1和connexin-43分子等心脏特异性标记物，能够分化成为心肌细胞，并与宿主心肌细胞形成耦联，参与宿主心脏的同步收缩。目前更倾向于MSCs的分泌功能。MSCs通过旁分泌和自分泌途径分泌大量的功能性细胞因子，包含有局部的免疫抑制、对纤维化过程的抑制以及对血管生成的支持作用等。

3修饰BMSCs的基因

BMSCs易于被外源基因转染并稳定表达，对其进行基因修饰可以使BMSCs具有更好的促血管再生、抗细胞凋亡、抗炎、修复心功能的作用。

3.1细胞因子相关基因单纯细胞移植有一定的局限性，为此将细胞移植与基因治疗联合起来。关于细胞因子的基因研究最多，通过细胞因子修饰的BMSCs可抬高细胞移植后的存活，改善细胞生存环境，在心肌梗死后心功能改善方面有广泛的应用。

血管内皮细胞生长因子(VEGF) 是目前发现的促血管生成作用的因子之一，将低氧环境诱导下经VEGF修饰的MSCs进行移植，与未修饰组比，VEGF表达进一步增加，促进血管增生，明显减小大鼠心肌梗死面积，增强BMSCs对梗死微环境的耐受，利于移植细胞存活，促进组织修复，但对心功能改善不明显〔3〕。血管生长素-1(Ang-1)也是一个促进血管生成的因子，用腺病毒将Ang-1基因导入BMSCs，将替代治疗和血管生成结合起来，促进血管生长，延缓心肌重塑，提高心功能〔4〕。

肝细胞生长因子(HGF)是具有调节细胞生长和运动及诱发血管生成的多功能细胞因子，也是一种特异的促内皮细胞生长因子，具有抑制细胞凋亡与组织重构、修复内皮损伤促血管内皮细胞分裂作用。用逆转录病毒载体对移植前的BMSCs进行预处理，使BMSCs过表达HGF，使移植的BMSCs在心肌梗死区HGF表达增加，改善局部微环境，减轻炎症反应，利于移植细胞存活，其机制与促进旁分泌机制有关。同时发现心肌梗死后2 w心肌注射BMSCs最有利〔5〕。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF)-2是成纤维细胞生长因子家族的基本成员，具有促细胞分裂，促进血管形成，参与损伤修复等多种生物学活性，对BMSCs进行该基因修饰可激活细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶及蛋白激酶C，调高BCL-2的表达，提高BMSCs的移植存活率，促进间充质干细胞分化为心肌样细胞，促进梗死区毛细血管新生，减小心肌梗死面积改善心功能〔6〕。

胰岛素样生长因子(IGF)-1在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。有学者将IGF-1导入BMSC中使BMSCs更耐受缺氧环境，移植成活率高，促进毛细血管生长，减小梗死面积，抑制心肌增厚，激活PI3K/Akt信号途径，减少细胞凋亡，通过基质衍生因子1α/趋化因子受体4轴(SDF-1α/CXCR4)促进细胞向梗死部位迁移〔7〕。也有学者采用逆转录病毒使BMSCs过表达CXCR4的方法，经静脉途径注射入心肌梗死大鼠体内，发现BMSCs的定向迁移明显增强，促进了细胞成活率，改善了左室重构，取得很好的疗效〔8〕。

转录因子是细胞内一类重要的调控蛋白，其特异地结合基因组DNA的顺式作用元件以调节基因的转录过程，GATA转录因子基因家族具有与特定DNA结合的锌指结构域，结扎左前降支造成心肌梗死后立即在梗死边缘区注射GATA-4过表达的间充质干细胞，细胞释放的细胞因子(IGF-1，VEGF)可促进血管生成和细胞存活，使细胞发挥更大的作用〔9〕。

炎症在冠心病发生发展过程中起重要的作用，白介素18(IL-18)是一个重要的多效能炎症细胞因子，IL-18结合蛋白(IL18BP)可拮抗IL-18的活性，过表达IL-18BP 的BMSCs可以促进VEGF分泌，减少细胞死亡，减小梗死面积，提高心功能〔10〕。趋化因子在炎症反应中具有重要作用，它们结合到趋化因子受体而起作用，研究发现通过对BMSCs进行趋化因子受体CCR修饰，心肌内注射可以减少心肌细胞凋亡，促进BMSCs向缺血区迁移，增加毛细血管密度，保护心功能〔11〕。肿瘤坏死因子(TNF)是一种真正的多效因子，具有多种生物学效应，心肌梗死时有炎症介导TNF-α产生，用重组腺相关病毒(rAAV)使BMSCs 过表达TNF受体(TNFR)发现可以提高心梗后左室功能，改善BMSCs生存，提高TNF-α在心肌及血清中的表达水平，提高TNFR蛋白水平在心肌梗死区的表达，通过提高细胞存活率进而提高细胞移植的效率〔12〕。细胞因子种类繁多，参与人体多种重要的生理功能，还有许多因子尚处于体外研究阶段，如何探讨更合适的基因进行修饰，进一步改善梗死心肌局部的血液循环、提高移植后干细胞的存活，更好地改善心肌梗死及梗死后心功能是我们的研究方向。

3.2信号通路相关基因PI3K-Akt信号途径是一条经典的信号途径，在细胞存活和抗凋亡中起重要作用。Akt又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，居PI3K/Akt信号传导通路核心部位，Akt能磷酸化一系列蛋白成分，通过多种途径抑制细胞凋亡，用腺病毒携带Akt修饰BMSCs可强化其修复猪心肌梗死后治疗效果〔13〕。

Wnt信号通路在复制和分化中起重要作用，Wnt是一类分泌型糖蛋白，通过自分泌或旁分泌发挥作用。Wnt11通过激活Wnt11非经典信号通路，在促进间充质干细胞向心肌细胞分化过程中发挥重要作用，Wnt11过表达的间充质干细胞移植能有效改善心功能〔14〕。糖原合酶激酶(GSK)3是生物体内许多信号通路的参与者，是Wnt信号通路的上游作用物，过表达糖原合成酶激酶(GSK)-3β的间充质干细胞通过促进干细胞生存，促进干细胞向心肌分化，动员心脏祖细胞，分泌细胞因子，增强毛细血管密度显著减小了心肌梗死面积，改善心肌梗死后心功能。研究还发现促生存作用及毛细血管密度增加主要是血管内皮生长因子A起作用，但去除它后仍可有心肌梗死面积减小及心功能改善。由此可见GSK-3β修饰的间充质干细胞是通过多种机制协同起作用提高间充质干细胞的治疗效率〔15〕。

分泌型卷曲相关蛋白2(Sfrp 2)是介导心肌存活和修复的重要干细胞分泌型蛋白，可以竞争结合wnt蛋白，从而抑制Wnt信号，其过量表达可以促使BMSCs体外增殖，增加毛细血管密度，缩小梗死面积，保护心功能，说明其自身具备保护缺氧受损的心肌细胞的功能〔16〕。

Notch 信号是细胞与细胞之间直接作用的主要信号通路之一，在细胞分化、血管生成以及机体发育过程中发挥极其重要的作用，在心血管系统它的影响包括血管重构、血管稳定性以及心脏发育，Notch1是Notch的受体，它修饰BMSCs后能帮助BNSCs更好地进行心肌梗死后心肌修复及心功能的恢复〔17〕。

3.3其他基因经基因修饰后，BMSCs相应的蛋白表达增加，干细胞的适应性增强，其修复能力加强。HSP20属于热休克蛋白(HSP)家族，是一个抗凋亡及抗氧化有关的酶，在缺血缺氧环境中对细胞具有保护作用，心肌梗死部位移植经HSP20修饰的BMSCs能激活Akt，减少细胞凋亡，促进分泌VEGF，FGF-2和 IGF-1，进而促进血管密度，有益于治疗心肌梗死〔18〕。

血红素氧合酶(HO)是血红素代谢途径的起始酶和限速酶，HO-1又称HSP32，是一种呈诱导性表达的酶，多种有害刺激均可诱导HO-1表达，，是细胞应激时重要的保护机制之一。HO-1修饰BMSCs 对移植到心肌梗死部位通过PI3K-Akt信号途径促进VEGF分泌，抑制干细胞凋亡，能增强其在缺氧及恶劣环境中的生存能力，最终改善了心肌梗死的预后〔19〕。

Bcl-2是具有明显抑制凋亡作用的基因，用阳离子脂质体法抗凋亡基因修饰BMSCs后，延长BMSCs 存活，有助于提高其移植治疗心肌梗死的效果〔20〕。存活素(survivin) 是IAP家族中分子量最小成员，在胚胎和各类肿瘤中均表达，具有强大的调节细胞增殖和抗凋亡功能，用慢病毒载体使BMSCs高表达survivin，心肌梗死后移植与对照组比VEGF分泌及毛细血管密度增加，心肌梗死面积小，抑制胶原沉积，改善远期预后〔21〕。E1A激活基因阻遏子(CREG) 是一种分泌型糖蛋白，CREG过表达明显抑制BMSCs凋亡，主要是通过抑制线粒体凋亡途径，使caspase-3减少，促进Akt磷酸化，减少p53表达，同时促进VEGF分泌，移植后可降低心肌梗死后心肌损害〔22〕。

3.4基因联合单基因修饰BMSCs虽取得较好的疗效。但由于心肌梗死心肌修复涉及多种机制，单种基因很难满足治疗需求，许多学者开始多基因修饰BMSCs的探索。如将Ang-1和Akt联合修饰BMSCs移植治疗心肌梗死，以满足血管生成和抗凋亡需求，达到了预期的结果，大鼠心功能得到了进一步的改善并显示出长期的治疗效果〔23〕。同样HGF及VEGF联合，放大BMSCs的内分泌效应，更好地改善心脏状况〔24〕。采用Csx/Nkx2.5 and GATA-4两种转录因子联合修饰，提高BMSCs向心肌细胞分化效率，增强毛细血管密度，改善心肌梗死后心功能〔25〕。所有结果均表明，多基因联合可起到一定的治疗效果叠加。但目前还没有公认的最佳基因改造方案，寻找更合适的基因联合修饰BMSCs为提供了又一研究方向。

心肌梗死后最终引起心功能不全是患者死亡的主要原因。现行的治疗方法不能从根本上修复坏死的心肌组织。MSCs是人们研究最深入的干细胞种类之一，特别是在修复病患及损伤组织、器官方面。自体和异体的MSCs都被证明能够参与组织再生。这类细胞易于采集、分离和体外扩增，避免了许多遗传和伦理的问题，除具有多向分化潜能，还具有抑制同种异体免疫反应的免疫调节作用。该细胞易于接受基因修饰，不仅可作为组织工程的种子细胞，而且也可作为基因治疗的良好工具。非病毒载体与病毒载体相比较无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中有着病毒载体不可替代的作用。然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。目前对BMSCs的基因修饰研究主要为单一基因的动物试验阶段，然而体内微环境是多种因子共同作用的结果，今后研究的方向是如何安全地将多种基因转入体内。基因工程在MSCs治疗心肌梗死中有广泛的应用前景。随着研究的深入，会有更多的基因靶点和基因工程技术应用于心肌梗死的干细胞治疗领域。

4参考文献

1Li SR，Qi XY，Hu FL，etal.Mechanisms of improvement of left ventricle remodeling by trans-planting two kinds of autologous bone marrow stem cells in pigs〔J〕.Chin Med J (Engl)，2008；121(23)：2403-9.

2Mirotsou M，Jayawardena TM，Schmeckpeper J，etal.Paracrine mechanisms of stem cell reparative and regenerative actions in the heart〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2011；50(2)：280-9.

3Kim SH，Moon HH，Kim HA，etal.Hypoxia-inducible vascular endothelial growth factor-engineered mesenchymal stem cells prevent myocardial ischemic injury〔J〕.Mol Ther，2011；19(4)：741-50.

4Sun L，Cui M，Wang Z，etal.Mesenchymal stem cells modified with angiopoietin-1 improve remodeling in a rat model of acute myocardial infarction〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007；357(3)：779-84.

5Wang S，Qin X，Sun D，etal.Effects of hepatocyte growth factor overexpressed bone marrow-derived mesenchymal stem cells on prevention from left ventricular remodelling and functional improvement in infarcted rat hearts〔J〕.Cell Biochem Funct，2012；30：574-81.

6Song H，Kwon K，Lim S，etal.Transfection of mesenchymal stem cells with the FGF-2 gene improves their survival under hypoxic conditions〔J〕.Mol Cells，2005；19(3)：402-7.

7Haider H，Jiang S，Idris NM，etal.IGF-1-overexpressing mesenchymal stem cells accelerate bone marrow stem cell mobilization via paracrine activation of SDF-1alpha/CXCR4 signaling to promote myocardial repair〔J〕.Circ Res，2008；103(11)：1300-8.

8Cheng Z，Ou L，Zhou X，etal.Targeted migration of mesenchymal stem cells modified with CXCR4 gene to infarcted myocardium improves cardiac performance〔J〕.Mol Ther，2008；16(3)：571-9.

9Li H，Zuo S，He Z，etal.Paracrine factors released by GATA-4 overexpressed mesenchymal stem cells increase angiogenesis and cell survival〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010；299(6)：H1772-81.

10Wang M，Tan J，Wang Y，etal.IL-18 binding protein-expressing mesenchymal stem cells improve myocardial protection after ischemia or infarction〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2009；106(41)：17499-504.

11Huang J，Zhang Z，Guo J，etal.Genetic modification of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability，migration，engraftment，and capillary density in the injured myocardium〔J〕.Circ Res，2010；106(11)：1753-62.

12Bao C，Guo J，Zheng M，etal.Enhancement of the survival of engrafted mesenchymal stem cells in the ischemic heart by TNFR gene transfection〔J〕.Biochem Cell Biol，2010；88(4)：629-34.

13Lim SY，Kim YS，Ahn Y，etal.The effects of mesenchymal stem cells transduced with Akt in a porcine myocardial infarction model〔J〕.Cardiovasc Res，2006；70(3)：530-42.

14Zuo S，Jones WK，Li H，etal.Paracrine effect of Wnt11-overexpressing mesenchymal stem cells on ischemic injury〔J〕.Stem Cells Dev，2012；21(4)：598-608.

15Cho J，Zhai P，Maejima Y，etal.Myocardial injection with GSK-3beta-overexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells attenuates cardiac dysfunction after myocardial infarction〔J〕.Circ Res，2011；108(4)：478-89.

16Alfaro MP，Pagni M，Vincent A，etal.The Wnt modulator sFRP2 enhances mesenchymal stem cell engraftment，granulation tissue formation and myocardial repair〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2008；105(47)：18366-71.

17Li Y，Hiroi Y，Ngoy S，etal.Notch1 in bone marrow-derived cells mediates cardiac repair after myocardial infarction〔J〕.Circulation，2011；123(8)：866-76.

18Wang X，Zhao T，Huang W，etal.Hsp20-engineered mesenchymal stem cells are resistant to oxidative stress via enhanced activation of Akt and increased secretion of growth factors〔J〕.Stem Cells，2009；27(12)：3021-31.

19Tsubokawa T，Yagi K，Nakanishi C，etal.Impact of anti-apoptotic and anti-oxidative effects of bone marrow mesenchymal stem cells with transient overexpression of heme oxygenase-1 on myocardial ischemia〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010；298(5)：H1320-9.

20Li W，Ma N，Ong LL，etal.Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function〔J〕.Stem Cells，2007；25(8)：2118-27.

21Fan L，Lin C，Zhuo S，etal.Transplantation with survivin-engineered mesenchymal stem cells results in better prognosis in a rat model of myocardial infarction〔J〕.Eur J Heart Fail，2009；11(11)：1023-30.

22Deng J，Han Y，Yan C，etal.Overexpressing cellular repressor of E1A-stimulated genes protects mesenchymal stem cells against hypoxia-and serum deprivation-induced apoptosis by activation of PI3K/Akt〔J〕.Apoptosis，2010；15(4)：463-73.

23Lai VK，Afzal MR，Ashraf M，etal.Non-hypoxic stabilization of HIF-Ialpha during coordinated interaction between Akt and angiopoietin-1 enhances endothelial commitment of bone marrow stem cells〔J〕.J Mol Med (Berl)，2012；90(6)：719-30.

24Deuse T，Peter C，Fedak PW，etal.Hepatocyte growth factor or vascular endothelial growth factor gene transfer maximizes mesenchymal stem cell-based myocardial salvage after acute myocardial infarction〔J〕.Circulation，2009；120(11 Suppl)：S247-54.

25Gao XR，Tan YZ,Wang HJ.Overexpression of Csx/Nkx 2.5 and GATA-4 enhances the efficacy of mesenchymal stem cell transplantation after myocardial infarction〔J〕.Circ J，2011；75(11)：2683-91.

〔2013-06-16修回〕

(编辑安冉冉)