布鲁氏菌基因组学研究进展

刘志国，王 妙，崔步云，刘日宏，夏咸柱

布鲁氏菌基因组学研究进展

刘志国1,2,3，王 妙3，崔步云4，刘日宏3，夏咸柱5

布鲁氏菌是一类革兰氏阴性、胞内寄生菌，缺乏经典的毒力因子，致病性不仅依靠侵袭力和内毒素，还有赖于较强的环境适应能力。目前，布鲁氏菌入侵机体和在胞内持续存在的机制尚未明确。布鲁氏菌基因组学研究不仅可全面了解布鲁氏菌的基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点，还可以对一些致病相关基因和重要的蛋白进行预测。该研究为开发研究疫苗和新型抗生素提供分子基础，从而为构建新的有效的布病治疗和防控策略提供理论依据。本文就布鲁氏菌的基因组组成、特征，全基因组测序分析、比较基因组研究进展予以概述。

布鲁氏菌；基因组；比较基因组学；进化基因组学

布鲁氏菌是一类重要的人兽共患病病原菌，不仅对人和多种动物致病，亦是一种潜在的生物武器[1]。目前，布鲁氏菌的致病机制、毒力基因以及在胞内持续存在的机制尚不完全明确，致使安全有效疫苗和药物的研发处于停滞。随着测序技术的发展，已有许多布鲁氏菌被测序分析，通过测序分析发现，不仅同一个种内部不同菌株之间基因组有较大的差异,有SNP缺失和插入，还有基因数目的差异；还发现同一种内不同菌株之间基因差异与基因水平转移有关，也就是说某个菌株的独有基因很可能是从别的细菌中水平转移而来，这样就造成了种内基因多样性，而这些差异基因大多都和一些特殊的表型有关，比如耐药、毒力等。因此，全基因组学研究不仅可以进行种内、种间的进化关系研究，还可以阐明分子致病机制，筛选、鉴定致病相关基因，为开发研究疫苗、新型抗生素提供新的策略。

1 布鲁氏菌基因组构成

布鲁氏菌属在分类上属根瘤菌目、布鲁氏菌科，各生物型的G+C含量为55%～59%，DNA高度同源，同源性均在90%以上，基因组大小和组成异常相似[2]，除B.suis 3型菌的基因组仅含1条大小为3.2 Mb染色体外，其余布鲁氏菌的基因组均由2条独立且完整的环状DNA染色体组成，大小分别为2.1 Mb和1.2 Mb。在2.1 Mb的大染色体上含有1个复制起始区，1.2 Mb的小染色体上含有1个质粒复制功能区[3]。通常编码3 200～3 500个开放阅读框[4]。

2 布鲁氏菌基因组特征

布鲁氏菌的基因组中无质粒、无温和噬菌体，有插入序列(IS)，但各个种型的拷贝数不同，从7个拷贝到30个拷贝不等。此外，还有较短的重复回文序列存在，而短重复回文序列、单核苷酸多态性、插入序列则是布鲁氏菌基因组多态性的主要来源。另外，布鲁氏菌基因组中还存在假基因，不同菌株中假基因的数量差别很大,田鼠型布鲁氏菌假基因最少，仅有63个；而牛种布鲁氏菌2 308则多达316个,假基因的积累反映了菌株的适应性进化。布鲁氏菌属的基因组成、特征基本相似，但各个种型之间稍有差别，而细微的差异使他们的致病性、毒力、环境适应性等各不相同，而这些细微的差异或许正是致病性和毒力差异的所在，系今后研究的立足点。

2.1 主要致病布鲁氏菌全基因组测序分析 全基因组测序分析不仅可用于基因遗传特性分析，还是一种强有力的基因分析工具，在鉴别和筛选布鲁氏菌差异基因、致病基因中具有重要的作用。牛种菌A13334的全基因组为3.3 Mb，由2条染色体组成,长度分别为2.1 Mb(ChrI)和1.2 Mb(ChrII)；G+C含量均为 57%；约有3 338个编码基因，其中2 182个位于染色体1，另1 153个位于染色体2；2条染色体约85%～87%的基因可以编码蛋白；基因组中有55个tRNA 基因 (其中41个位于1号染色体，14个位于2号染色体) 和 9个 rRNA基因(其中6 位于1号染色体，3个位于2号染色体)[5]。羊种布氏菌 ADMAS-G1的基因组全长为3.3 Mb，G+C含量为57.3%，编码3 388个基因，其中3 325个是蛋白编码基因，2 610个为功能蛋白、715为假设蛋白。预测有RNA 基因63个，包括 57个tRNA 和6个rRNA 基因。58个基因与致病机制有关，virBIII型,IV和V分泌路径以及独立蛋白组件TatC分泌应答等相关路径；另有44个防御机制基因，其中包括负责 ABC 型药运输系统、多药耐外排泵、限制性内切酶等基因[6]。羊种布鲁氏菌BmIND1的基因组有3 284 360个碱基，有3 360个蛋白编码基因，G+C含量为57.2%，包含49个tRNA、3个rRNA和964个直系同源基因(KEGG)。另外，研究还发现有58个基因具有分泌功能并可能参与宿主-病原体相互作用[7]。多个致病布鲁氏菌株的全基因组测序分析极大的丰富布鲁氏菌基因组信息，对筛选和识别布鲁氏菌致病基因及毒力岛有重要的意义。

2.2 非主要致病布鲁氏菌的全基因组测序分析 目前，绝大多数的布病由羊种菌和牛种菌引起，而猪种菌、犬种菌等非主要致病菌的全基因组测序分析有助于了解布鲁氏菌的进化、变异以及致病差异等相关信息。犬种布鲁氏菌SVA13的基因组G+C含量为57.24%，2条环状染色体分别为2.1 Mb和1.2 Mb。全基因组包含3 093个基因，其中2 950个为编码基因，有5S、16S和23S RNA 3种核糖体，16个操纵子、1个非编码基因、55个tRNA 操纵子。在基因组中有57个移码突变。1号染色体包含60个长度>8个碱基的重复串联序列，2号染色体中有30个长度为2～264个碱基拷贝数为2～11的串联重复序列[8]。基因型为ST26型的鲸鱼型布氏菌TE10759-12的基因组G+C含量为57%,基因组由2条染色体组成，分别为2.1 Mb和1.2 Mb。另外，有9个完整的rRNA，44 个转运操纵子和2 611个编码基因[9]。在猪种4型菌NCTC10385、鲸鱼型菌NCTC12891T、B.inopinatastrain CAMP 6436T和沙林鼠种ATCC23459T的基因组内均检测到了串联重复序列，其中猪种4型菌有84个串联重复序列，最大出现串联重复序列数为4，而鲸鱼型、沙林鼠种和B.inopinata的串联重复序列分别为55,49和63个，串联重复频率分别为7、10和7[10]。基因组序列中的插入/缺失事件可能在不同宿主偏好性上有一定影响，进而与其致病性有一定的关联。非主要致病性布鲁氏菌与牛羊布鲁氏菌的全基因组特征几乎相似，而致病性却相差甚远，作者认为筛选两者之间的差异基因或非编码基因是解开致病性差异的候选方法，而布鲁氏菌基因组测序是揭开布鲁氏菌之谜的绝佳路径。

3 布鲁氏菌野毒株比较基因组学

比较基因组学不仅可以进行全基因组的比较和系统发生的进化关系分析，还可进行细菌基因组多态性的研究，从而揭示基因潜在的功能、阐明物种进化关系及基因组的内在结构[11]。牛种野毒株9-941、猪种1 330和羊种16 M的比较基因组学研究表明，它们的基因组十分相似，基因含量和基因组成几乎相同，99%以上的氨基酸序列相同，基因组的开放阅读框个数也极为相近，它们的主要区别来自于sORFs和大的插入删除，该发现为确定布鲁氏菌的致病性和毒力表型提供了重要依据[12]。1株ST8型羊种菌的比较基因组学研究结果显示，该菌株共有182处小的缺失和102处插入，并预测有2 836个单核苷酸多态性[13]。对羊种强毒株M28-12和羊种疫苗株M5、M111以及猪种菌S2的比较基因组学研究发现M5、M28-12和 M111共有1 370个单核苷酸多态性，其中89个来自 M5和M111以及M28-12，61个来自猪种1330和猪种菌S2，并指出这些多核苷酸多肽性位点可能来自于疫苗株的突变，对设计新的更加安全的疫苗具有重要的启示[14]。牛种菌BCB027与牛种菌强毒株相比，基因组中有137个小的缺失，其中有34个位于编码区；有3 507个多态性位点，其中2 731个位于编码区，表明从非主要宿主体分离的菌株在遗传方面有较大的改变[15]。牛种菌A13334与牛种9-941和Rb51相比有48个特有基因；与104M基因组高度相似，但毒力差异较大，差异可能系由某些基因片段的丢失和水平转移有关。A13334基因组特有的37个基因中绝大多数基因编码涉及维持生命周期的多种酶类，其余则直接或间接的与毒力相关，而这些基因的丢失可能是104M毒力衰减的原因之一[16]。布鲁氏菌的比较基因组学研究加快了新的功能基因和主要致病差异基因的发现，进而为研究布鲁氏菌致病等相关机制提供了参考。

4 布鲁氏菌疫苗株S19比较基因组学

为了揭开S19是有何种遗传特性使得其可以作为疫苗保护牛群以及强毒株导致流产的秘密，研究者对S19进行了全基因组测序，并通过对新获得的S19基因组信息和牛种菌9-941以及2 308的基因组进行比对，发现有24个基因与布鲁氏菌的毒力相关，其中有4个基因与毒力直接关联，这4个独立关联基因在强毒株中编码外膜蛋白、三赤藓糖醇的吸收或代谢相关蛋白质基因。该研究不仅将对了解布鲁氏菌细胞内脂质转运、蛋白转运和代谢机制的特点有极大的帮助，也为阐明S19作为疫苗候选株具有良好的免疫保护和证实其他菌株具有致病性提供了佐证[17]。布鲁氏菌比较基因组学已经成为研究布鲁氏菌基因组的有力方法，在布鲁氏菌筛选毒力基因、预测重要基因和蛋白方面发挥了重要作用。然而，作者认为传染病实际上是致病决定基因功能的表现，今后的比较基因组学研究重点在于致病决定基因的比较和筛选。

5 布鲁氏菌进化基因组学

进化基因组学是通过研究生物进化过程中基因组的动态变化和基因的变异，从而揭示生物类群的亲缘关系和进化规律[18]。通过进化足迹特征及直系、旁系同源评估等预测布鲁菌祖先属于需氧、可自由生活、能运动的异养生物，栖息于根瘤菌植物中[19]。基于近缘菌株的比较分析推测，布鲁氏菌及其祖先是一种能自由生活的生物有机体，之后逐渐进化为动物寄生菌。目前准确的进化进程仍然是未知的，但研究显示与布鲁氏菌基因组中基因的缺失、获得和修饰等有关[20]。基于全基因组序列的进化分析显示，绵羊附睾种是一种比较古老的布鲁氏菌，而牛种和羊种布鲁氏菌则是分化程度较高的种；通过比较种系发育推测牛种菌和羊种菌有共同祖先[21]。布鲁氏菌基因组不仅缺乏种内重组的依据，而且基因组中的部分差异区段具有外源DNA的特征,且在差异区段在不同菌株中的分布不同,表明这些差异区段是从外部获得的；与基于看家基因的进化树相比,部分差异区段在不同种型间呈现规律性的分布，而另外一些并未随进化关联而呈现获得与缺失的规律性变化，表明基因的获得与缺失可能与布氏菌的适应性进化相关[22-23]。布鲁氏菌进化基因组不仅对了解布鲁氏菌的种内、种间进化，推测菌种起源有重要作用，而且对阐明布鲁氏菌的微进化及适应性进化机制具有重要意义。

6 结 语

当前，布鲁氏菌基因组学已成为学术界关注的热点和研究的重点，随着细菌基因组测序技术的进一步发展成熟，基于新一代高通量测序技术的全基因组测序，不仅可以预测布鲁氏菌的重要基因、蛋白以了解其功能和可能机制；同时，在布鲁氏菌的致病性和防治方面，可以鉴定致病相关基因、开发和研究疫苗、开发新型抗生素等；在布鲁氏菌的遗传进化方面，可以研究种内、种间进化关系、了解进化规律；还可成为研究布鲁氏菌遗传进化机制和预测筛选关键基因的重要工具。因此，布鲁氏菌基因组学研究必将在布病的防治研究工作中发挥重要作用。

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Progress in genomic research ofBrucella

LIU ZHi-guo1,2,3,WANG Miao3,CUI Bu-yun4,LIU Ri-hong3,XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot01008,China; 2.UlanqabBureauforHealth,Ulanqab012000,China; 3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControl,Ulanqab012000,China; 4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPreventionCollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China; 5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

Brucellais a gram-negative, intracellular bacterium. Lacking of classical virulence factors, pathogenesis was not only relying on the invasiveness and endotoxin, but also depends on the strong ability to adapt to the environment. At present, the mechanisms of invasion of the body and in the intracellular of continued presence is not clear. TheBrucellagenomic research can not only fully explain the characteristics ofBrucellagene composition, molecular evolution, virulence factors and pathogenic mechanism, but also be used for some of the pathogenic genes and important protein prediction. And to offered candidate loci for further reasearch. Meanwhile, provided a molecular basis for the research and development of new vaccines and antibiotics, so as to supply a theoretical basis for the construction of new effective treatment and prevention strategies of brucellosis. This is an overview of genomic forBrucella, includeBrucellagenome composition and characteristics, analysis of the whole genome sequencing, comparative genomic, and evolutionary genomics research progress.

Brucella; genomic; comparative genomics; evolution genomics

s: Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn; Cui Bu-yun, Email: cuibuyun@icdc.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.018

夏咸柱,Email:xiaxzh@cae.cn 崔步云,Email:cuibuyun@icdc.cn

1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 10018; 2.乌兰察布市卫生局，乌兰察布 012000; 3.乌兰察布市地方病防治中心， 乌兰察布 012000; 4.中国疾控中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室，感染性疾病诊治协同创新中心，北京 102206; 5.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122

R378.5

A

1002-2694(2015)12-1177-04

2015-03-12；

2015-06-11

内蒙古卫计委医疗卫生科研项目(No.201301094)资助

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)