猪附红细胞体病的诊断技术综述

文│牛艺儒 杜娟 左光大 史贵丽（山西省长治市畜牧兽医局）

附红细胞体病（eperythrozoonosis，简称附红体病）是由附红细胞体（Eperythrozoon，简称附红体）引起的一种人畜共患传染病，以贫血、黄疸、发热为特征。该病最早发现于20世纪20年代，直到1950年确定猪的黄疸性贫血是由附红体引起的，这样才逐渐被人们重视起来。研究表明，目前，该病已广泛分布于世界许多国家和地区，在对人类造成一定影响的同时，也给畜牧业生产带来了经济损失。

一、病原特性

由于附红体在多种动物身上均可见，在不同动物中寄生的各有其名，寄生在猪身上的称为猪附红体（E.suis）和小附红体（E.parvum）。光镜下，猪附红细胞体呈环形、球形、卵圆形以及杆状等多种形态，它们多在红细胞表面成团或单独寄生，也有的在血浆中呈游离状态，被附红体寄生后的红细胞呈多种形态。

附红体对苯胺色素易着色，革兰氏染色阴性，姬姆萨染色呈紫红色，瑞氏染色呈淡蓝色。Gulland等用扫描及透射电子显微镜，观察到有猪附红细胞体感染的病猪，附红细胞体寄生的红细胞呈凹陷球状或短杆状。

附红体对干燥和化学药物比较敏感，0.5%苯酚37℃经过3小时即可杀死，一般常用的消毒剂在几分钟内即可致其死亡。但它对低温冷冻的抵抗力较强，可在低温下存活数年之久。

附红体是条件性致病菌，有特异性，在机体抵抗力低下或处于某些应激状态时，猪附红体感染率上升，甚至引起发病。

二、临床症状

该病常感染率极高，猪附红体寄生于红细胞或者游离于血浆中，任何年龄段的猪均可发病，并且容易与其他疾病混合感染，多数情况下呈隐性经过。急性黄疸、高热、贫血为该病的主要临床特征，潜伏期不定，平均为7天左右。

不同阶段的猪感染附红细胞体后主要临床症状如下：新生仔猪和断奶仔猪的发病率和死亡率都比较高，早期症状为发热，体温高达40℃以上，皮肤发红，食欲不振或者废绝，精神沉郁，贫血、虚弱，康复后的仔猪常生长发育停滞。育肥猪生长缓慢，严重消瘦，抵抗力下降，容易感染其他疾病。母猪发病后繁殖障碍，生殖能力下降，出现不发情、受胎率降低、流产和死胎等症状。慢性感染的猪极度消瘦，皮肤苍白，呼吸困难，生长缓慢，接近停滞。血液学检查可见红细胞数减少，血红素下降，血浆白蛋白、β球蛋白、γ球蛋白均下降，淋巴细胞及单核细胞上升等。病程长短不一，短者几天，长者数月，甚至数年，严重者死亡。

三、诊断研究

根据临床表现可做出初步判断，确诊需做进一步实验室检查。

1.直接镜检。这种方法仍是诊断该病的主要手段。采集病猪的静脉抗凝血，滴1滴于载玻片上，加入等量生理盐水进行稀释，混匀后盖上盖玻片，置于显微镜下观察其形态，患病的可见红细胞形态结构改变，边缘不整齐呈多种形态。附红体聚集于红细胞表面，数量不等，运动状态也不同，形态常呈杆状、环形、球形、逗点形、卵圆形、不规则形状等。

由于附红体对苯胺易于着色，因此可以用不同染液进行染色后观察判断。

2.电镜观察。在扫描电镜下，可见附红体呈大小不等的球形、卵圆形、杆状等多形态，附有附红细胞体的红细胞呈星芒状或不规则的多边形，红细胞膜产生凹陷、变形。在透射电镜下，附红体大小不等，呈多球性小体，并且可见细长状的纤毛，无细胞壁、细胞器和细胞核，仅有单层限制膜包裹。该病不同的感染形式或处于不同阶段的发病过程，其形态也可能不相同。

娄红军等在4580倍扫描电镜下，在红细胞表面可观察到有大小不一链球状、杆状附红细胞体附着，红细胞呈波浪形。在透射电镜12000倍下观察，附红细胞体为一近似球形结构物，边缘密度较中间密度大，附着点有纤丝状物与红细胞相连。

3.补体结合试验（CFT）。该方法是在1958年由Splitter首次用于对猪附红细胞体病的诊断，这种方法对于诊断急性病例效果较好。在临床上，发病后的第三天，血清检查呈阳性，2～3周后逐渐转为阴性，对于慢性带菌猪一般呈阴性反应。Schuller W.等运用CFT对人工感染附红细胞体病的猪血液中的抗体滴度进行了检测，试验结果发现抗体滴度变异较大，因此，该方法只适合于对猪群的检测，而对少量的猪的检测效果并不理想，即此方法不适用于对个体进行诊断。

4.间接血凝试验（IHA）。Smith等于1975年首次建立了用间接血凝试验检测猪附红细胞体的抗体，并把抗体滴度为1∶40作为该病为阳性的标准，这种方法灵敏度高，可检测出CFT反应转为阴性的耐过猪。张守发等采用不同动物的红细胞经醛化、鞣酸化后致敏，也取得了较好的效果。目前，应用IHA研究人工感染猪附红细胞体病是一种常用的血清学检测方法，这种方法在一定程度上可以检测出潜在感染的病猪。

5.酶联免疫吸附试验（ELISA）。1996年Lang等人用除去红细胞的绵羊附红细胞体抗原对羊进行ELISA检测，并认为这种方法比IHA的敏感性高8倍。他们认为用这种方法检测猪附红细胞体的敏感性要高于IHA法，并且特异性较好，不与猪和牛的其他疾病发生交叉反应，然而这种方法不适合用于对小猪及公猪的诊断，也不适用于该病急性期的诊断。Hoelzle L.E.等对猪附红细胞体的血清学诊断方法进行了改进，用间接ELISA和免疫杂交试验法进行诊断，检出率为100%。

6.间接荧光抗体试验（IFAT）。这种方法最早用于诊断牛附红细胞体病，在接种的第四天抗体首次出现，之后，随着病原的增多，到第二十八天时达到高峰，而这种方法也比血液涂片法敏感很多。韩一超等采用这种方法，对部分规模化猪场和养猪户的猪进行了流行病学调查和诊断，通过试验发现，在隐性感染的猪群中，IFAT方法诊断的阳性率比直接镜检的高出11.2个百分点，并且差异显著。因而，这种方法也可以用于对猪附红细胞体病的诊断检查。

7.分子生物学技术。随着分子生物学技术在各个领域的广泛运用，自上世纪末开始，国内外有大量关于动物附红细胞体分子诊断方法的报道，主要有以下几种：

（1）聚合酶链式反应（PCR）。PCR特点是可将单拷贝的靶序列放大百万倍，该方法的优点就是灵敏性高。在临床上，既可以检测出急性感染的病例，同样也可检测出隐性感染的，并且检测快速、特异性好，因此，这是一种敏感、有效的猪附红细胞体病原确诊方法，主要用于种原鉴定。

Gwaltney S.M.等首次使用PCR方法检测纯化的猪附红细胞体感染的猪的组织和血液，扩增结果表明这种方法敏感性更高，更加快速，特异性也更强，并且这种方法同样适用于诊断血液中少量附红细胞体的慢性感染的病猪。Hoelzle L.E.等将纯化后的猪附红细胞体基因组酶切后获得一段短片段，根据该片段设计引物建立PCR方法，对有明显临床症状的猪和处于潜伏期的猪进行检测，结果表明该方法是检测阴性感染附红细胞体动物的一种好方法。

国内研究者使用此方法对该病的研究起步较晚，但发展迅速，相继建立了各种动物的附红细胞体病的PCR检测方法。结果表明该方法敏感性高、特异性好、快速、准确，可以对猪附红细胞体病进行病原学诊断和研究。

（2）荧光定量PCR方法（FQPCR）。闫若潜等经过条件优化，成功建立了猪附红细胞体的TaqMan荧光定量PCR检测方法，比较发现该方法比普通PCR灵敏度高100倍，并且特异性也高，重复性好，准确率也高，较普通方法检出的阳性率也高。朱绍辉等在国内首次建立了SYBR GreenI实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体，结果表明该方法有较好的特异性、敏感性和广谱性，从而为猪附红细胞体病的临床诊断检测提供了新的技术手段。

（3）DNA探针技术。该方法的优势在于特异性强，而缺点是敏感性较低，尤其是在轻度感染时检出率很低，基本上等同于镜检的水平。Oberst R.D.等从基因文库中克隆出一段序列KSU-2作为探针，可用于鉴别诊断感染猪与隐性感染猪血样。另外，该探针与犬、马、牛、猫等血样DNA之间不发生杂交，但这种方法敏感性较低，不适合于猪附红细胞体病的早期诊断。

四、展望

从20世纪中期猪附红细胞体病发现至今，该病已成为一种日益严重的人畜共患病。近年来，我国部分地区开始发生此病，并造成了严重的经济损失，从而使人们开始对此病加强了关注。

目前，国内外对于该病的研究还不是很深入，尤其是国内，虽然许多研究者已经建立了许多免疫学和分子生物学的诊断方法，且这些方法也比常规方法特异性好，敏感、高效，但也存在诸多不便于操作、试剂昂贵、无统一判断标准等亟待解决的问题，对于国内不同地区的流行情况没有很好的掌握，因此，随着对附红细胞体病研究的深入，有必要首先对国内不同地区的流行情况了解，逐步建立实验室动物模型，运用先进的分子生物学技术，进而开发用于治疗该病的疫苗，相信在不久的将来很有可能有效控制附红细胞体病的发生和传播，从而促进畜牧业的发展。