三种除蛋白方法对复方乙肝宁多糖及蛋白的影响

李 静 王定雪

1.贵阳中医学院实验中心，贵州 贵阳 550002;2.贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002

三种除蛋白方法对复方乙肝宁多糖及蛋白的影响

李 静1王定雪2

1.贵阳中医学院实验中心，贵州 贵阳 550002;2.贵阳中医学院第一附属医院，贵州 贵阳 550002

目的：对乙肝宁复方多糖进行三种除蛋白处理，考查除蛋白效果。方法：采用苯酚-硫酸法在490 nm处测定糖的含量，以多糖回收率和蛋白去除率为指标。结果：Sevag法、5%三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率分别为57.41%、88.27%、64.90%，蛋白去除率分别为53.06%、20.23%、28.90%。结论：5%三氯乙酸法对多糖的保留效果最好，Sevag法除蛋白效果最好，本实验为多糖除蛋白的方法提供了实验依据。

乙肝宁复方；多糖；苯酚-硫酸法；除蛋白

目前公认的多糖物质是主要吸湿性成分之一，所以首先对乙肝宁颗粒复方水提液中的多糖进行探讨。乙肝宁颗粒[1]是《中国药典》2010年版(Ⅰ部)收载的成方制剂，具有补气健脾、活血化瘀、清热解毒的作用，主要用于慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎属湿热内蕴、肝郁脾虚、气虚血瘀证者，对急性肝炎也有一定疗效。多糖是乙肝宁颗粒的主要有效成分之一，具有多种生理活性，但由于多糖和蛋白质结合紧密，采用传统水提醇沉法得到的沉淀主要是多糖和蛋白质的混合物，为了最大限度地保留多糖和去除蛋白质，本实验采用苯酚-硫酸法测定乙肝宁复方多糖的含量，对比Sevag法、5%三氯乙酸法、三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率和蛋白质去除率。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 SP-756可见分光度计(上海光谱仪器有限公司)；AR124CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；RE52-99型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水多用真空泵(巩义予华仪器有限责任公司)；HH-S型水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；低速离心机；DZF-6050真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试剂 苯酚(AR，湖南汇虹试剂有限公司，20090824)；硫酸(AR，湖南省株洲市化学工业研究所)；葡萄糖(AR，天津市科密欧化学试剂有限公司，20101023)；乙醇(AR，湖南汇虹试剂有限公司，20110521)；三氯乙酸(AR，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20090120)；氯仿(AR，天津市大茂化学试剂厂，20070803)；正丁醇(AR，湖南汇虹试剂有限公司，20090810)。中药材有十二味：白花蛇舌草、茵陈、金钱草、党参、蒲公英、制何首乌、牡丹皮、丹参、茯苓、白芍、白术、川楝子(中药饮片购自安徽惠隆中药饮片有限公司，质量检测皆符合《中国药典》2010年版Ⅰ部的规定)。

2 方法与结果

2.1 乙肝宁复方多糖溶液的制备 按照2010版药典乙肝宁颗粒[1]处方的十二味中药材，加十倍量水浸泡30min，水蒸气回流法提取2h，过滤，滤渣加八倍量水回流提取2h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪在0.9kPa和65℃条件下浓缩至适量，向浓缩液中加入无水乙醇使其含醇量达到70%，摇匀，置4℃冰箱，静置过夜。离心，过滤，滤液收集备用；离心、过滤后的沉淀，放置于真空干燥箱中以60℃恒温干燥至恒重，得粗多糖至冰箱中备用。精确称取上述粗多糖3g，放入100ml容量瓶中，超声溶解，加蒸馏水定容至刻度即得到乙肝宁复方多糖溶液。

2.2 乙肝宁复方多糖含量测定方法的建立

2.2.1 6%苯酚溶液的配制 量取苯酚6ml，加蒸馏水定容至100ml，置棕色瓶内，放于4℃冰箱备用。

2.2.2 标准溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖20.20mg，用蒸馏水溶解定容至100ml，摇匀，即得0.2020mg/ml的葡萄糖标准溶液。

2.2.3 最大吸收波长[2]的确定 取葡萄糖标准溶液1ml，加入具塞试管中，迅速加入6%苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，摇匀，室温放置5min，沸水浴15min，流水速冷至室温。以蒸馏水同法操作为空白，置比色杯中于400～700nm波段处进行扫描，光谱扫描曲线确定最大吸收波长为490nm。(见图1)

2.2.4 标准曲线的建立 采用苯酚-硫酸法，用移液枪分别吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml葡萄糖标准液至10ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。摇匀后，用移液枪分别吸取1ml加入具塞试管中，并加入6%苯酚溶液1.0ml，浓硫酸5.0ml，摇匀，室温放置5min，沸水浴15min, 流水速冷至室温，以第一份为空白于490nm测定吸光度。(见表1)

以吸光度A对葡萄糖浓度C回归，得回归方程为:A=0.0087C-0.0112，其中R2=0.9995，葡萄糖浓度在10.1～101μg/ml范围内与吸光度线性关系良好。

2.2.5 精密度试验 精密量取葡萄糖标准溶液200μL共六份，分别置具塞试管中，加蒸馏水补足至1ml，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按标准曲线的制备项下操作，结果吸光度分别为0.315、0.319、0.321、0.315、0.322、0.322，则RSD=1.55%(n=6)。

2.2.6 稳定性试验 精密量取葡萄糖标准溶液200μl，置具塞试管中，加蒸馏水补足至1ml，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按标准曲线的制备项下操作，将供试品溶液完成显色后，每隔15min测吸光度一次，连续测定八次(见表2)。

试验结果表明葡萄糖标准溶液在90min内显色稳定性良好，90min时吸光度的RSD=2.51%(n=7)，105min时吸光度的RSD=3.69%(n=8)。

2.2.7 重复性试验 精密称取乙肝宁复方多糖(批号为20100102)六份各3.00g，加蒸馏水定容至100ml，精密量取50μl溶液于10ml容量瓶中，加蒸馏水补足至刻度，分别精密量取1ml溶液置具塞试管中，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按标准曲线的制备项下操作，显色并测定吸收度分别为0.514、0.549、0.546、0.549、0.531、0.527，结果按照平均含量计算为41.93%，RSD=2.62%(n=6)，表明本法的重复性良好。

2.2.8 回收率试验 分别精密量取已知含量的乙肝宁复方多糖溶液六份，每份1ml，每组分别加入葡萄糖标准溶液 (60.25μg/ml)1ml混合均匀，精密移取1ml溶液置具塞试管中，按标准曲线的制备项下方法显色并测定吸光度，结果测定平均回收率为101.12%，RSD=1.09%(n=6)(见表3)。

2.2.9 乙肝宁复方多糖的含量测定 精密量取3批乙肝宁复方多糖3.00g，加蒸馏水定容至100ml，精密量取50μl溶液于10ml容量瓶中，加蒸馏水补足至刻度，分别精密量取1ml溶液置具塞试管中，自“并加入6%苯酚溶液1.0ml”按标准曲线的制备项下操作，显色并测定吸收度分别为0.569、0.526、0.575，从标准曲线上读出供试品溶液中多糖以葡萄糖计的含量，计算即得多糖百分总含量[3]。结果表明乙肝宁复方多糖的平均百分含量以葡萄糖计是43.77%，RSD=3.68%(n=3)(见表4)。本实验使用500g中药材，经过提取纯化得到70g沉淀，由计算可知乙肝宁复方药材中所含多糖的量为6.13%。

2.3 蛋白质的含量测定 以生理盐水(0.9%氯化钠溶液)为空白对照，采用紫外吸收直接测定法[4]，测定待测溶液在280nm和260nm两种波长的吸光度，并将A280nm和A260nm波长处的的吸光度值代入下面公式计算蛋白质的浓度。

C=1.45 A280nm-0.74 A260nm

式中C：蛋白质浓度(mg/ml)；A280nm：溶液在280 nrn处测得的吸光度；A260nm：溶液在260nm处测得的吸光度。

2.4 除蛋白方法

2.4.1 Sevag法(Sevag method) 取20ml乙肝宁多糖溶液，加入氯仿4ml，正丁醇0.8ml，混合物剧烈震荡，静置一段时间后， 1500r/min离心30min，分出水层和有机层交界处的变性蛋白。重复上述操作三次，直至无变性蛋白出现，收集上清液加水定容至40ml，测定其多糖浓度和蛋白质浓度。

2.4.2 5%三氯乙酸法[5](5% TCA method) 取20ml乙肝宁多糖溶液，加入20ml 5%三氯乙酸溶液，混合均匀后4℃下静置4h，1500r/min离心15min，弃去沉淀，收集上清液加水定容至40ml，测定其多糖浓度和蛋白质浓度。

2.4.3 三氯乙酸-正丁醇法[6](TCA-Butanol method) 取20ml乙肝宁多糖溶液，加入三氯乙酸16.5ml，正丁醇3.5ml，混合震荡1min，静置1h，离心弃去沉淀，收集上清液加水定容至40ml，测定其多糖浓度和蛋白质浓度。

2.4.4 不除去蛋白的溶液(The retention of protein solution) 作为空白组 取20ml乙肝宁多糖溶液，加水定容至40ml，离心取上清液，测定其多糖浓度和蛋白质浓度。

2.4.5 结果 精密量取50μl待测溶液，加水定容至5ml，取1ml溶液于具塞试管，按照苯酚-硫酸法测定多糖的含量，记录A490nm，另外精密量取200μl待测液，加水定容至6ml，按照紫外吸收直接测定法测定蛋白质浓度，记录A280nm，A260nm，实验结果见表5。

3 讨论

本实验采用水蒸气回流提取法，向浓缩液中加入乙醇使含醇量达到70%，使用水提醇沉法分离多糖，以除去单糖、寡糖、苷类及生物碱等醇溶性成分，得到乙肝宁复方多糖。

用苯酚-硫酸法，以葡萄糖计算测定乙肝宁复方多糖溶液中的总多糖含量，多糖在硫酸作用下水解成单糖，并能迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合反应生成橙黄色化合物，用分光光度法测定其含量，简便快捷，适合乙肝宁复方多糖的含量测定。

对比三种除蛋白方法，Sevag法的多糖回收率最低(57.41%)，蛋白去除率最高(53.06%)；三氯乙酸-正丁醇法的多糖回收率(64.90%)和蛋白去除率(28.90%)居中;5%三氯乙酸的蛋白去除率虽然最低(20.23%)，但是比较接近三氯乙酸-正丁醇法(28.90%)，并且该法的多糖回收率最高(88.23%)，相比Sevag法多糖回收率高出了30.82%，可以避免Sevag法反复操作，有机试剂消耗量大，其中氯仿是毒性物质，有可能会造成多糖活性下降和有机试剂残留的缺点。同时对比三种处理方法的多糖溶液静置后的稳定性，放置于4℃冰箱，72h后观察现象，结果显示5%三氯乙酸法溶液稳定性较好，澄明度优于其他两种方法。实验表明，5%三氯乙酸法对多糖的保留效果最好，Sevag法除蛋白效果最好，但是多糖损失量较多。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:403-404.

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Influence of three methods of removing protein about compound Polysaccharide in Yiganning

LI Jing1WANG Dingxue2

1.GuiYang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002,China; 2.The first Hospital Affliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550001,China

Objective In order to test effect to three methods to removing protein of compound polysaccharides in Yiganning. Methods The polysaccharide content was determined by phenol-sulfuric acid method comparing colors at 490 nm . With polysaccharide recovery rate and protein removal rate as an indicator. Results Sevag method, 5% TCA method ,TCA-Butanol method of polysaccharide recovery rates were 57.41%,88.27%,64.90%, while protein removal rates were 53.06%,20.23%,28.90%. Conclusion 5% TCA method on polysaccharide retention effect is better, Sevag method protein removal effect is better. The experiment provides basis for the study of removing protein method.

compound Yiganning; polysaccharide; phenol-sulfuric acid method; removing protein

R914

A

1007-8517(2015)18-0020-03

2015.06.25)