长链非编码RNA对能量代谢和相关疾病发生发展的作用*

荣 灿，胡 云

随着高通量测序技术的发展和ENCODE计划揭示，曾一度被认为是无功能的“转录噪音”的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，近年来被证实在细胞分化、生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用［1］。其中长链非编码 RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA，在哺乳动物基因组中，有4% ～9%的序列产生的转录本是lncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1%)，其中许多lncRNA与人类疾病密切相关，参与调节基因表达、招募染色质修饰物、调节X染色体失活、染色体重组、基因组印记、蛋白质折叠和蛋白质活性等［2］。与微小 RNA(microRNA，miRNA)相比，lncRNA序列更长、空间结构更复杂、信息含量更加丰富，可能是遗传信息表达调控网络的一个核心［3-4］。目前lncRNA的功能和作用机制虽然尚不完全清楚，但已有研究显示lncRNA参与内分泌代谢疾病的发生发展，成为诊断和治疗肥胖、糖尿病、高脂血症等疾病标志物和潜在的治疗靶点。本文就lncRNA的生物学功能及其在内分泌代谢疾病研究中的进展作综述。

1 lncRNA的生物学特性和作用机制

lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，位于细胞核或胞质内，缺乏蛋白质编码功能。根据lncRNA与其相邻蛋白编码基因的位置关系，lncRNA可分为正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、基因内lncRNA和基因间 lncRNA［2］，这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。lncRNA具有保守的二级结构、剪切形式以及精确的亚细胞定位［5］，在不同组织和发育阶段的表达具有特异性［6-7］，这些特征对其在疾病发生中的作用有很重要影响。

lncRNA可通过各种分子机制在X染色体失活、基因印迹、染色体修饰、转录、翻译、蛋白质的活性调控以及RNA的可变剪切调控等过程中发挥着重要的调节作用。研究表明lncRNA的作用方式如下:(1)lncRNA通过招募染色质重构和组蛋白修饰复合体到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制基因表达。如HOXC基因簇转录的lncRNA HOTAIR，会募集染色质修饰复合体PRC2，并将其定位到HOXD基因簇位点，改变该区域的染色质修饰状态，进而抑制HOXD基因表达［8］。同样，Xist、Airn 及 Kcnq1ot1 这些 lncRNA 能通过招募相应的重构复合体，实现表观遗传学沉默［9-11］。(2)lncRNA通过作为配基，与转录因子结合形成复合体，控制基因转录活性，如小鼠的lncRNA Evf2，一段转录自Dlx5和Dlx6基因间的超保守远端增强子，它能募集转录因子DLX和MECP2蛋白至 Dlx5/6附近，调控 Dlx5、Dlx6和 Gadl的表达［12］。还有一些lncRNA本身就是转录因子，如lncRNA HSR1可以同HSF1、eEF1A共同形成复合物，在细胞热休克应激反应时调节热休克蛋白表达［13］。(3)lncRNA通过与编码蛋白基因转录本形成互补双链，直接参与到mRNA可变剪切、RNA编辑、蛋白翻译及转运等转录后调控过程中，如lncRNA Zeb2能够与HOX位点转录的mRNA的一个内含子的5’端剪切位点形成双链，抑制该内含子被剪切［14］，该区域含有Zeb2蛋白表达必须的核糖体结合点，从而增加Zeb2蛋白的表达量。lncRNA BACE1-AS与正义BACE1 mRNA相结合增强BACE1 mRNA的稳定性，从而增加BACE1蛋白的表达量［15］。(4)lncRNA可作为一种竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)与miRNA之间互相调控［16］。在一些肿瘤细胞和特定组织中，lncRNA携带有某些miRNA的“种子序列”，像海绵一样结合miRNA，从而阻止miRNA同其靶mRNA结合［17］。(5)lncRNA可加工产生小分子RNA，作为小分子RNA(如miRNA、piRNA、mascRNA)的前体分子转录［18］。

另外，随着对lncRNA研究越来越深入，研究者也将发现更多lncRNA调控模式。最新研究发现lncRNAs还可以轻易地找到并结合附近的基因，在可重组遗传物质的帮助下，拉动其它的相关基因，迁移到新的位点，构建起一个“功能空间”(compartment)，在那里许多基因同时受到调控［19］。

2 lncRNA参与调控糖尿病的发生发展

糖尿病是一种由遗传因素与环境因素相互作用而引起的糖代谢性疾病。目前，已经报道的2型糖尿病基因易感位点有近60个。而Pullen等［20］发现55个2型糖尿病的易感基因位点中，有9个主要SNP位点150 kb范围内含有胰岛 lncRNA，提示lncRNA与糖尿病易感性相关。Morán等［21］检测了人胰岛β细胞基因组转录图谱发现1 128个lncRNAs，Refseq数据库中具有注释的基因中只有9.4%是胰岛特异性表达的，但是55%的基因间 lncRNA和40%的反义 lncRNA具有胰岛组织特异性，这些lncRNA在胚胎胰腺祖细胞时是失活的，在胰岛细胞分化和成熟过程中逐渐被激活，推测人类的胰岛细胞lncRNA是以高度组织特异模式转录的。

胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要发病机制。胰岛β细胞位于胰岛内，是体内胰岛素的唯一来源。Morán等［21］进一步检测了14个具有胰岛细胞特异性lncRNA在2型糖尿病患者胰岛β细胞中的表达情况，发现lncRNA HI-LNC25显著上调，抑制其表达可正向调节胰岛转录因子GLIS3 mRNA的表达。GLIS3编码一种胰岛转录因子，它的突变发生在包括2型糖尿病风险变异位点在内的单基因糖尿病中，提示反义lncRNA能调控人类胰岛β细胞单基因疾病的蛋白编码基因。同样，细胞周期素依赖性激酶4抑制因子(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4，INK4)位点的反义 lncRNA(antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL)作为一个基因敏感位点与冠心病及2型糖尿病密切相关。Jarinova等［22］发现 ANRIL转录物与 p15INK4b有很好的相关性，在全血中，ANRIL转录物能够直接影响p15INK4b的表达。而动物模型研究显示p15INK4b的过表达可引起小鼠胰岛发育不全并出现糖尿病症状［23］。Cunnington 等［24］发现 lncRNA ANRIL 表达下降与糖尿病相关风险的易感基因突变(rs10811661-T和rs2383208-A)密切相关，其表达下调可以导致糖尿病在内的多种疾病的发生。

迄今发现80%已知的印记基因倾向于成簇分布于16个不同的基因组区域内，进而形成不同的印记基因簇，这些基因簇内包含着来源于不同父母本的多个基因［25］。有趣的是，在目前已知的印记簇内，都包含有lncRNA。一些印记基因编码与生长因子和能量代谢相关的剂量敏感性蛋白，且与在同一等位基因相连的抑制蛋白质编码基因表达的lncRNA相关。lncRNA MEG3(maternal expressed gene 3)是小鼠母系印记基因Glt2(gene-trap locus 2)的人类同系物，位于人染色体14q32.3上，长度约为1.6 kb，由10 个外显子组成［26］。Wallace等［27］发现与 1 型糖尿病相关性最强的SNP rs941576位于14号染色体14q32.28的一个完整印迹区域，而此区域位于lncRNA MEG3的第6个内含子内。进一步研究发现lncRNA MEG3单核苷酸多态性可调节父系表达基因跨膜蛋白delta-like 1(DLK1)和逆转录转座子样1(retrotransposon-like 1，RTL1)的表达，从而导致1型糖尿病的发生与发展。Kameswaran等［28］发现 lncRNA MEG3在2型糖尿病患者的胰岛内表达下调，其表达下调可能与MEG3启动子超甲基化有关，而MEG3启动子的超甲基化可能是miRNA-29a调控通路作用的结果［29］，因此miRNA-29a可能通过某种调控通路参与lncRNA MEG3的甲基化，从而导致糖尿病的发生与发展。Kcnq1ot1是由遗传印记Kcnq1区的一个内含子的印迹控制区父源性非等位基因转录而成的、长度为91.5 kb的长链反义非编码RNA［11］。Kcnq1ot1的启动子在母本染色体上被甲基化而在父本染色体上非甲基化，在父本中Kcnq1ot1 RNA产物与8～10个蛋白质编码基因的沉默相关联。Morán等［21］发现2型糖尿病患者胰岛β细胞内Kcnq1ot1表达明显高于正常人，上述研究提示，lncRNA通过参与调控印记基因表达，在一定程度上影响胰岛β细胞的功能，可能是人群糖尿病发生发展的遗传因素之一。

胰岛素抵抗主要指胰岛素敏感细胞对胰岛素介导的葡萄糖摄取及处置的抵抗。胰岛素通过与靶器官上特异的胰岛素和胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor，IGFR)结合调节葡萄糖的代谢。目前已有研究发现，lncRNA能够通过调控IGFR参与调控胰岛素信号转导系统［30］。Keniry等［31］发现lncRNA H19通过加工生成miR-675，抑制胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)mRNA的翻译，间接减少IGF-1R的表达。Mutskov等［32］发现用高浓度葡萄糖刺激胰岛β细胞后，lncRNA Airn表达上调。进一步研究发现Airn通过折叠胰岛素样生长因子2型受体(IGF-2R)启动子区域抑制RNA聚合酶Ⅱ的募集，最终抑制IGF-2R表达［33］。此外，Ellis等［34］发现用胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)处理大肠癌细胞后，lncRNA CRNDE的核转录本表达下降，反之，当干扰lncRNA CRNDE中一段高度保守序列后，细胞内胰岛素/IGF信号通路应答受抑制，提示结直肠瘤差异表达转录物lncRNA CRNDE可能既受到胰岛素/IGF的调节，又反作用于胰岛素/IGF信号通路。

上述研究表明，lncRNA在胰岛细胞功能和胰岛素信号转导方面起着重要作用，为糖尿病发病机制的研究提供了一个新的方向。

3 lncRNA参与调控脂肪代谢

肥胖是一种遗传、环境等多种因素所致体内能量过剩而引起机体脂肪总含量过多和(或)局部含量增多及分布异常，并可导致胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压、高脂血症、冠心病甚至危及生命的慢性代谢性疾病。机体内主要存在2类脂肪组织:白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)以储存脂肪为主要功能，过多积聚会形成肥胖;棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)通过非寒颤性产热机制，将储存的脂肪以热能的形式释放出来，在机体的能量代谢与体温维持等生物过程中发挥着重要的作用。

Sun等［35］通过对脂肪细胞分化过程中mRNA及带polyA尾的长链非编码RNA的表达谱进行了系统分析，发现1 734个编码基因及175个lncRNAs在白色及棕色脂肪细胞分化过程中被强烈诱导表达，其中有26种lncRNA在棕色和白色脂肪细胞由脂肪前体细胞分化为成熟细胞的过程中上调，敲除其中调控作用最强的10种lncRNA后，成熟脂肪细胞几乎完全可以去分化为前体脂肪细胞，且脂肪细胞内脂质积累显著下降。Yi等［36］分析了在3T3-L1细胞脂肪形成过程中带polyA尾长链非编码RNA的潜在功能，发现一类长度约为136 kb的超长链基因间非编码 RNA(slincRAD)参与脂肪分化，进一步用slincRAD特异性的小干扰RNA使前脂肪细胞中的slincRAD表达沉默后，发现脂滴形成调控因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)水平降低，脂质积累减少，证实了slincRAD参与脂肪细胞分化过程的作用。Xu等［37］发现PPARγ的共转录激活子lncRNA SRA在成熟的白色脂肪组织高表达，参与3T3-L1细胞脂肪脂滴形成，增加脂肪细胞胰岛素敏感性及葡萄糖摄取功能，参与调控细胞周期、胰岛素和炎症信号的信号通路。

lncRNA除了可调控白色脂肪的形成外，还参与了棕色脂肪细胞的分化与代谢功能。棕色脂肪细胞表面有肾上腺素受体，细胞内含有大量线粒体。线粒体内膜上的解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)可引起线粒体氧化呼吸的电子传递和ATP产生解偶联作用，从而降低脂肪酸氧化代谢的产能效率，大量能量以热能的形式散发［38］。Zhao等［39］发现棕色脂肪lncRNA 1(Blnc1)作为核lncRNA，通过与转录因子EBF2形成核糖核蛋白复合物刺激UCP1基因和线粒体基因的表达，从而促进棕色和米色脂肪细胞分化和功能。另外，研究发现棕色脂肪与骨骼肌细胞有共同的分化来源，都源自Myf5+成肌细胞［40］。而在分化成熟过程中，棕色脂肪和骨骼肌在形态和功能上逐渐产生一定的差异。Zhang等［41］比较了棕色脂肪和骨骼肌的长链非编码RNA表达谱，发现了704上调和896下调差异表达的lncRNAs，进一步发现lncRNA AK003288可能通过作用于亲联蛋白2(Jph2)在棕色脂肪和骨骼肌分化成熟及相互转化中发挥作用。上述研究提示，lncRNA参与了棕色脂肪前体细胞向成熟的脂肪细胞分化的过程，并且可能在成肌祖细胞向功能特异性细胞定向分化过程中起到了指导性的作用，以lncRNA为靶标，挖掘参与棕色脂肪生成的分子机制，将有可能促进解决棕色脂肪获取的技术难题，从而为肥胖的治疗带来新的方向。

然而，机体内不同部位的脂肪组织也存在一些差异，lncRNA在脂肪中的作用具有位点的特异性。Divoux等［42］通过分析人体脂肪异质性的基因调控通路，发现lncRNA HOTAIR表达于臀部脂肪组织中而在腹部脂肪组织中无表达，这种差异在体外分化过程中依然存在且第4天差异最为显著，腹部前体脂肪细胞中异位表达的HOTAIR可增加细胞成脂分化率，且成脂分化相关基因PPARγ和LPL的表达显著增加。

上述研究均表明，lncRNA参与脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化的过程和脂滴的积累过程，且具有位点特异性，但具体的机制尚未阐明，尚需进一步的研究探索。

4 总结和展望

疾病的发生是细胞内多个分子多个环节作用失调的结果，蛋白编码基因仅仅是疾病发生过程中复杂分子网络相互作用中的一部分。相对于蛋白编码序列以及小分子RNA，lncRNA的研究还仅仅处于起步阶段。lncRNA在哺乳动物基因组中普遍存在，拥有信号分子、诱饵分子、引导分子和骨架分子等不同角色，基因表达的每一个阶段几乎都有lncRNA参与调控，包括转录起始、延长、RNA加工、RNA稳定和翻译等生物学过程。

众多证据表明许多内分泌代谢疾病的发生发展与lncRNA的突变或失调有关，成为遗传学和分子生物学关注的新热点。lncRNA作为疾病诊断的标志物和潜在的治疗靶点，对于诊断和治疗肥胖、糖尿病、高脂血症等内分泌代谢疾病具有重要意义。

［1］ Consortium EP.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome［J］.Nature，2012，489(7414):57-74.

［2］ Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136(4):629-641.

［3］ Tsai MC，Manor O，Wan Y，et al.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes［J］.Science，2010，329(5992):689-693.

［4］ Dinger ME，Gascoigne DK，Mattick JS.The evolution of RNAs with multiple functions［J］.Biochimie，2011，93(11):2013-2018.

［5］ Mercer TR，Dinger ME，Mattick JS.Long non-coding RNAs:insights into functions［J］.Nat Rev Genet，2009，10(3):155-159.

［6］ Dinger ME，Amaral PP，Mercer TR，et al.Long noncoding RNAs in mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation［J］.Genome Res，2008，18(9):1433-1445.

［7］ Prasanth KV，Spector DL.Eukaryotic regulatory RNAs:an answer to the genome complexity conundrum［J］.Genes Dev，2007，21(1):11-42.

［8］ Rinn JL，Kertesz M，Wang JK，et al.Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs［J］.Cell，2007，129(7):1311-1323.

［9］ Zhao J，Sun BK，Erwin JA，et al.Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome［J］.Science，2008，322(5902):750-756.

［10］ Nagano T，Mitchell JA，Sanz LA，et al.The Air noncoding RNA epigenetically silences transcription by targeting G9a to chromatin［J］.Science，2008，322(5908):1717-1720.

［11］ Pandey RR，Mondal T，Mohammad F，et al.Kcnq1ot1 antisense noncoding RNA mediates lineage-specific transcriptional silencing through chromatin-level regulation［J］.Mol Cell，2008，32(2):232-246.

［12］ Bond AM，Vangompel MJ，Sametsky EA，et al.Balanced gene regulation by an embryonic brain ncRNA is critical for adult hippocampal GABA circuitry［J］.Nat Neurosci，2009，12(8):1020-1027.

［13］ Shamovsky I，Ivannikov M，Kandel ES，et al.RNA-mediated response to heat shock in mammalian cells［J］.Nature，2006，440(7083):556-560.

［14］ Beltran M，Puig I，Pea C，et al.A natural antisense transcript regulates Zeb2/Sip1 gene expression during Snail1-induced epithelial-mesenchymal transition［J］.Genes Dev，2008，22(6):756-769.

［15］ Mohammad AF，Farzaneh M，Ahmad MK，et al.Expression of a noncoding RNA is elevated in Alzheimer’s disease and drives rapid feed-forward regulation of β-secretase expression［J］.Nat Med，2008，14(7):723-730.

［16］蔺新秀，杨 蔓，夏 天.竞争性内源RNA与肿瘤发生［J］.中国病理生理杂志，2014，30(3):563-566.

［17］ Wang J，Liu X，Wu H，et al.CREB up-regulates long non-coding RNA，HULC expression through interaction with microRNA-372 in liver cancer［J］.Nucleic Acids Res，2010，38(16):5366-5383.

［18］Ogawa Y，Sun BK，Lee JT.Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways［J］.Science，2008，320(5881):1336-1341.

［19］ Engreitz JM，Pandya-Jones A，McDonel P，et al.The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome［J］.Science，2013，341(6147):1237973.

［20］ Pullen TJ，Rutter GA.Could lncRNAs contribute to betacell identity and its loss in Type 2 diabetes?［J］.Biochem Soc Trans，2013，41(3):797-801.

［21］ Morán I，Akerman I，van de Bunt M，et al.Human β cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissuespecific，dynamically regulated，and abnormally expressed in type 2 diabetes［J］.Cell Metab，2012，16(4):435-448.

［22］ Jarinova O，Stewart AF，Roberts R，et al.Functional analysis of the chromosome 9p21.3 coronary artery disease risk locus［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(10):1671-1677.

［23］ Moritani M，Yamasaki S，Kagami M，et al.Hypoplasia of endocrine and exocrine pancreas in homozygous transgenic TGF-β1［J］.Mol Cell Endocrinol，2005，229(1-2):175-184.

［24］ Cunnington MS，Koref MS，Mayosi BM，et al.Chromosome 9p21 SNPs associated with mutiple disease phenotypes correlate with ANRIL expression［J］.PLoS Genet，2010，6(4):e1000899.

［25］ Wan LB，Bartolomei MS.Regulation of imprinting in clusters:noncoding RNAs versus insulators［J］.Adv Genet，2008，61:207-223.

［26］ Schuster-Gossler K，Bilinski P，Sado T，et al.The mouse Gtl2 gene is differentially expressed during embryonic development，encodes multiple alternatively spliced transcripts，and may act as an RNA［J］.Dev Dyn，1998，212(2):214-228.

［27］ Wallace C，Smyth DJ，Maisuria-Armer M，et al.The imprinted DLK1-MEG3 gene region on chromosome 14q32.2 alters susceptibility to type 1 diabetes［J］.Nat Genet，2010，42(1):68-71.

［28］ Kameswaran V，Bramswig NC，McKenna LB，et al.Epigenetic regulation of the DLK1-MEG3 microRNA cluster in human type 2 diabetic islets［J］.Cell Metab，2014，19(1):135-145.

［29］ Braconi C，Kogure T，Valeri N，et al.MicroRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer［J］.Oncogene，2011，30(47):4750-4756.

［30］ Panda AC，Grammatikakis I，Yoon JH，et al.Posttranscriptional regulation of insulin family ligands and receptors［J］.Int J Mol Sci，2013，14(9):19202-19229.

［31］ Keniry A，Oxley D，Monnier P，et al.The H19 lincRNA is a developmental reservoir of miR-675 that suppresses growth and Igf1r［J］.Nat Cell Biol，2012，14(7):659-665.

［32］Mutskov V，Felsenfeld G.The human insulin gene is part of a large open chromatin domain specific for human islets［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(41):17419-17424.

［33］ Federica S，Florian MP.Silencing by the imprinted Airn macro lncRNA:transcription is the answer［J］.Cell Cycle，2013，12(5):711-712.

［34］ Ellis BC，Graham LD，Molloy PL.CRNDE，a long noncodingRNA responsive to insulin/IGF signaling，regulates genes involved in central metabolism［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843(2):372-386.

［35］ Sun L，Goff LA，Trapnell C，et al.Long noncoding RNAs regulate adipogenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110(9):3387-3392.

［36］ Yi F，Yang F，Liu X，et al.RNA-seq identified a superlong intergenic transcript functioning in adipogenesis［J］.RNA Biol，2013，10(6):991-1001.

［37］ Xu B，Gerin I，Miao H，et al.Multiple roles for the noncoding RNA SRA in regulation of adipogenesis and insulin sensitivity［J］.PLoS One，2010，5(12):e14199.

［38］ Himms-Hagen J.Does brown adipose tissue(BAT)have a role in the physiology or treatment of human obesity?［J］.Rev Endocr Metab Disord，2001，2(4):395-401.

［39］ Zhao XY，Li S，Wang GX，et al.A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation［J］.Mol cell，2014，55(3):372-382.

［40］ Seale P，Bjork B，Yang W，et al.Prdm16 controls a brown fat/skeletal muscle switch［J］.Nature，2008，454(7207):961-967.

［41］ Zhang J，Cui XW，Shen YH，et al.Distinct expression profiles of LncRNAs between brown adipose tissue and skeletal muscle［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，443(3):1028-1034.

［42］ Divoux A，Karastergiou K，Xie H，et al.Identification of a novel lncRNA in gluteal adipose tissue and evidence for its positive effect on preadipocyte differentiation［J］.Obesity，2014，22(8):1781-1785.