骨髓间充质干细胞对心肌梗死治疗的研究进展

刘金峰，凌　斌

昆明医科大学第四附属医院重症医学科，昆明 650051



骨髓间充质干细胞对心肌梗死治疗的研究进展

刘金峰，凌斌

昆明医科大学第四附属医院重症医学科，昆明 650051

摘要：骨髓间充质干细胞拥有心肌再生的能力，移植后能够产生心肌样细胞，促进血管生成，分泌多种生长因子与细胞因子。本文总结了心肌修复的分子机制，探讨了心肌梗死后心肌潜在的再生能力，回顾了以往研究中干细胞移植对心肌梗死后心肌修复的治疗效果，为制定临床策略提供了新的思路。

关键词：骨髓间充质干细胞；心肌梗死；干细胞移植

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：108-112

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是世界范围内的主要死因之一。与其他器官不同，MI后心脏没有再生心肌细胞的能力来修复受损组织，因此具有完整舒缩功能的心肌细胞坏死或调亡后，其原来的位置上会病理性重构形成瘢痕组织，造成缺血性损伤，导致心功能下降。尽管现行的各种疗法旨在减少损伤程度，但瘢痕的减少和心肌细胞的再生却是传统疗法无法解决的。干细胞治疗的发展为临床治疗MI带来了新的机遇。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stem cells，BMSCs)容易分离培养，可扩增并重新作为自体细胞进行移植，降低了免疫反应风险，即使是同种异体移植细胞，也不引起排斥反应[1]。越来越多的研究表明，干细胞的旁分泌功能在心肌治疗中占有重要的地位[2]，故探讨旁分泌因子以及提高BMSCs分泌条件十分重要。本文总结了近年来BMSCs的研究成果，重点分析了现有证据对临床治疗MI的可行性，试图寻找差异潜在的原因，探讨未来干细胞疗法发展的方向。

BMSCs

BMSCs也称骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)，是具有多向分化潜能并具有自我复制能力的成体干细胞，来源于人、鼠、兔等骨髓基质细胞的体外扩增培养，其分化需要特定因素、营养物与环境因素的严格控制。BMSCs具有向受损部位归巢的优点，对治疗无病灶损伤非常有利，且BMSCs缺乏组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)与T-细胞共刺激分子[3]，使异体移植的安全性大大增加。这些特点使干细胞应用前景十分广阔，成为治疗MI的候选细胞之一。

BMSC对MI的修复机制

心肌样细胞分化MI可导致明显的心肌细胞减少和瘢痕组织形成，而剩余心肌细胞无法重建坏死组织，造成心脏功能代偿或恶化。BMSCs可以被诱导生成心肌样细胞，Orlic等[4]将其移植到小鼠心脏，结果发现移植细胞向心肌样细胞分化。Fukuda等[5]研究证实，经5-氮杂胞苷诱导3个月后，小鼠BMSCs的细胞超微结构与心肌细胞相似，能够同步收缩，但5-氮杂胞苷具有抑制DNA甲基化的作用，拥有潜在的生物学毒性。然而，仍有其他诱导分化为心肌样细胞的方法，如地塞米松、抗坏血酸，此类方法有着更安全的诱导分化途径[6- 7]。

血管形成移植BMSCs后遇到的一个棘手问题是心脏内微环境。在溶栓成功或血管再通的前提下，干细胞移植可能将营养物质运送到梗死区域，使这一区域的部分细胞得以存活，这也许是细胞治疗的最佳时间。在接下来的数天及后续治疗中，注射干细胞到相对有利的梗死心脏区域，对血管再生有着极大帮助。而血管对局部缺血与新生心肌样细胞氧气、营养物质的运送又至关重要。急性MI后，BMSCs移植后心肌重塑的过程中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在BMSCs移植后的心肌修复过程中发挥关键作用。Markel等[8]通过下调VEGF移植BMSCs，结果发现，与正常组相比，研究组的心肌功能恢复显著降低。Gao等[9]则采用转入VEGF基因上调VEGF的方式，结果显示，与正常组相比，研究组梗死区域的血管密度增加更明显。基质细胞衍生因子- 1(stromal cell-derived factor- 1，SDF- 1)可对受损心脏细胞移植后的细胞迁移与归巢发挥重要作用，其通过磷脂酰肌醇- 3羟基激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)抑制剂几乎完全阻断BMSCs的迁移，这证明SDF- 1/CXCR4轴介导的BMSCs迁移是通过激活PI3K/AKT信号转导的[8]，而表达的SDF- 1能有效促进血管生成[10]。因此，以上结论为MI后BMSCs移植血管生成途径与分子机制提供了理论依据，也为最大化的血管生成提供了可以借鉴的方法。

旁分泌机制干细胞可以分泌多种细胞因子与生长因子，包括：VEGF、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)-1、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-1、白细胞介素(interleukin，IL)- 6、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)-2、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)- 9等[11- 15]，这些细胞因子与生长因子以旁分泌信号分子通路作用参与抗凋亡、抗纤维化、促进心肌再生与血管生成等[12- 13]。Mias等[15]研究表明，α-平滑肌肌动蛋白的表达以及心脏成纤维细胞的胶原分泌，都伴随着MMP- 2/MMP- 9活性的刺激与膜型MMP- 1的表达，MMP和MMP的内源性抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)在MI后心脏重构的衰减中可发挥重要作用。BMSCs移植后心脏形态与功能的改善，可伴随着心室纤维化的显著下降。MMP/TIMP通路是细胞外调节蛋白激酶(extracellular-signa1regulated kinase，ERK1/2)，可抑制MMP/TIMP，从而抑制心肌纤维化[14]。此外，Crisostomo等[16]研究表明，旁分泌作用是BMSCs移植的重要途径，TNF-α、内毒素(lipopolySaccharide，LPS)与缺氧可显著增加人MSCs的VEGF、FGF- 2、HGF、IGF- 1等心脏保护因素的产生，核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和ERK可介导人干细胞生长因子的产生，其中NF-κB可促进上述细胞因子的表达，而JNK与ERK则对干细胞有抑制作用，但不影响其产生FGF- 2、HGF、IGF- 1的能力。旁分泌为干细胞移植带来复杂的变化，与干细胞的心肌再生、血管生成作用相辅相成，共同为损伤部位带来积极作用。

免疫调节BMSCs具有抑制T淋巴细胞增殖的作用。研究发现，该作用取决于细胞的培养环境与移植后体内的微环境[17- 18]。Meisel等[19]研究发现，BMSCs所表达的功能吲哚胺2，3-二氧化酶蛋白能够抑制同种异体T细胞的应答。Ryan等[20]在后续实验中揭示出这种效果可能是在干扰素-γ触发后才会由BMSCs释放。在对NK细胞抑制方面，Sotiropoulou等[21]认为，NK细胞抑制增殖的组合效应是通过BMSCs-NK细胞的细胞间接触及分泌的干细胞因子包括TGF-β和前列腺素E2完成的，提示BMSCs对NK细胞的细胞毒性抑制有着多种机制。此外，BMSCs可释放血红素加氧酶- 1，这是一种在心肌缺血损伤中重要的抗氧化应激和移植物的存活蛋白，在MI后早期可同时保护移植的干细胞以及生存的心肌细胞，并改善心脏功能[22]。

BMSC心肌修复的临床研究

BMSC移植时间与剂量

移植时间：干细胞移植治疗MI的移植时间点选择尤为重要。由于炎症的过程，MI后5 d内移植的细胞可能会发生严重损伤[23]，虽然最佳时间点没有确定，但最有可能在MI发病后的7～14 d间[24]。Janssens等[25]通过移植后4个月随访证实，安慰剂组与24 h内移植细胞组对比，后者并不增加心肌功能的恢复，其可能归因于粒细胞对移植细胞的吞噬作用，另外一种可能就是5 d后的移植有利于细胞早期转移[26]。

移植剂量：Clifford等[27]对近年来BMSCs治疗MI患者的临床资料进行统计分析，结论显示出移植剂量应在108以上，并指出对严重的心脏功能障碍MI干细胞移植治疗会更加有效。Zhang等[28]将17项MI后骨髓细胞移植的随机对照试验进行荟萃分析，结果表明，只有当注入剂量大于108的BMSCs，才可以实现对左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)的显著作用。但上述结果中都没有提到最大剂量的限制，这也是细胞移植安全性的关键。

BMSC移植的效果与安全性

移植的临床效果：BMSC应用于临床以来，临床结果对其效果的评价也越来越多。Zhang等[29]对8项试验共725例MI后患者进行分析，结果显示，与对照组相比，BMSC组的LVEF升高4.37%。另一项关于7项研究660例患者的系统分析结果显示，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)后移植可显著改善LVEF，降低左心室收缩末期容积，减少血管再狭窄与心律失常，降低死亡与临床再梗死的发生率[23]。Wollert等[30]研究指出，BMSCs移植后主要改善梗死区域相邻的心肌节段收缩功能，但没有改善心室重构。Janssens等[25]通过自体干细胞移植后发现，其并不增加MI后左心室整体功能恢复，但可显著减少梗死面积，可能对梗死重塑产生有利影响，移植细胞量、再灌注时间与梗死面积大小等方面的差异都可能影响临床的终点。Wollert等[30]还评价了PCI后BMSC移植6个月后的LVEF，结果发现对照组和移植组分别增加了0.7%和6.7%，并且细胞移植不增加不良事件的风险、支架内狭窄或心律失常。最近研究显示，在6个月的时间点上BMSCs对LVEF的恢复有着良好的效果[31]。Gao等[32]采用单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，SPECT)分别检测了PCI后12与24个月的LVEF，结果显示，与基线水平相比，其心肌灌注和LVEF水平均无显著差异。Meyer等[33]的结果与之类似，但其研究的MI恢复过程中，BMSC移植组的LVEF恢复的更快。Rodrigo等[34]评估了治疗5年后左心室功能与生存率的情况，结果显示干细胞移植获益不大。总之，不同结果为BMSC移植可行性带来挑战，值得肯定的是，BMSCs移植后短期内可使患者获益，其长期结果的差异可能与旁分泌作用的持续时间、对照组心肌代偿有关。然而，LVEF并非唯一的评价方法，目前大多数技术仅限于MRI或SPECT等，仍然需要更多方法来全面评估心脏功能的恢复，如二维斑点追踪超声心动图技术，它可以探测整体与局部的左心室功能变化，比LVEF等更加敏感。

移植的安全性：由于BMSCs大小为22～25 μm，毛细血管直径为8～10 μm，骨髓单个核细胞大小为8～12 μm，体外扩增的干细胞明显大于骨髓单核细胞，因此BMSCs移植可以阻塞微血管[35]。有学者检索了1950～2011年采用BMSCs治疗疾病的文献，共36项研究1012例患者，其中包括8项随机对照研究321例患者，对不良事件发生的分析结果显示，BMSCs是安全的[36]。

总结与展望

综上，干细胞为MI及其他组织损伤的修复提供了一定的治疗前景，今后的研发方向是显著改善病程的细胞制品，继续探索干细胞分化的机制，并根据不同的分子机制研究新的靶向干预措施，寻找定向分化的最佳办法。此外，还应该对干细胞的分泌与趋化作用、免疫调节的安全性进行评价。

参考文献

[1]Minguell JJ，Erices A. Mesenchymal stem cells and the treatment of cardiac disease[J]. Exp Biol Med(Maywood)，2006，231(1)：39- 49.

[2]Fox JM，Chamberlain G，Ashton BA，et al. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking[J]. Br J Haematol，2007，137(6)：491- 502.

[3]Jiang S，Kh Haider H，Ahmed RP，et al. Transcriptional profiling of young and old mesenchymal stem cells in response to oxygen deprivation and reparability of the infarcted myocardium[J]. J Mol Cell Cardiol，2008，44(3)：582- 596.

[4]Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium[J]. Nature，2001，410(6829)：701- 705.

[5]Fukuda K. Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymal stem cells for cardiovascular tissue engineering[J]. Artif Organs，2001，25(3)：187- 193.

[6]Shim WS，Jiang S，Wong P，et al.Exvivodifferentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，324(2)：481- 488.

[7]Fukuda K，Fujita J. Mesenchymal，but not hematopoietic，stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction in mice[J]. Kidney Int，2005，68(5)：1940- 1943.

[8]Markel TA，Wang Y，Herrmann JL，et al. VEGF is critical for stem cell-mediated cardioprotection and a crucial paracrine factor for defining the age threshold in adult and neonatal stem cell function[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(6)：H2308-H2414.

[9]Gao F，He T，Wang H，et al. A promising strategy for the treatment of ischemic heart disease：mesenchymal stem cell-mediated vascular endothelial growth factor gene transfer in rats[J]. Can J Cardiol，2007，23(11)：891- 898.

[10]Tang J，Wang J，Yang J，et al. Mesenchymal stem cells over-expressing SDF- 1 promote angiogenesis and improve heart function in experimental myocardial infarction in rats[J]. Eur J Cardiothorac Surg，2009，36(4)：644- 650.

[11]Weil BR，Markel TA，Herrmann JL，et al. Mesenchymal stem cells enhance the viability and proliferation of human fetal intestinal epithelial cells following hypoxic injury via paracrine mechanisms[J]. Surgery，2009，146(2)：190- 197.

[12]Gnecchi M，Zhang Z，Ni A，et al. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy[J]. Circ Res，2008，103(11)：1204- 1219.

[13]Li Z，Guo J，Chang Q，et al. Paracrine role for mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction[J]. Biol Pharm Bull，2009，32(8)：1343- 1346.

[14]Wang Y，Hu X，Xie X，et al. Effects of mesenchymal stem cells on matrix metalloproteinase synthesis in cardiac fibroblasts[J]. Exp Biol Med，2011，236(10)：1197- 1204.

[15]Mias C，Lairez O，Trouche E，et al. Mesenchymal stem cells promote matrix metalloproteinase secretion by cardiac fibroblasts and reduce cardiac ventricular fibrosis after myocardial infarction[J]. Stem Cells，2009，27(11)：2734- 2743.

[16]Crisostomo PR，Wang Y，Markel TA，et al. Human mesenchymal stem cells stimulated by TNF-alpha，LPS，or hypoxia produce growth factors by an NF kappa B-but not JNK-dependent mechanism[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2008，294(3)：C675-C682.

[17]Shi Y，Hu G，Su J，et al. Mesenchymal stem cells：a new strategy for immunosuppression and tissue repair[J]. Cell Res，2010，20(5)：510- 518.

[18]Chabannes D，Hill M，Merieau E，et al. A role for heme oxygenase- 1 in the immunosuppressive effect of adult rat and human mesenchymal stem cells[J]. Blood，2007，110(10)：3691- 3694.

[19]Meisel R，Zibert A，Laryea M，et al. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2，3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation[J]. Blood，2004，103(12)：4619- 4621.

[20]Ryan JM，Barry F，Murphy JM，et al. Interferon-gamma does not break，but promotes the immunosuppressive capacity of adult human mesenchymal stem cells[J]. Clin Exp Immunol，2007，149(2)：353- 363.

[21]Sotiropoulou PA，Perez SA，Gritzapis AD，et al. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells[J]. Stem Cells，2006，24(1)：74- 85.

[22]Zhang S，Lu S，Ge J，et al. Increased heme oxygenase- 1 expression in infarcted rat hearts following human bone marrow mesenchymal cell transplantation[J]. Microvasc Res，2005，69(1- 2)：64- 70.

[23]Zhang S，Sun A，Xu D，et al. Impact of timing on efficacy and safety of intracoronary autologous bone marrow stem cells transplantation in acute myocardial infarction：a pooled subgroup analysis of randomized controlled trials[J]. Clin Cardiol，2009，32(8)：458- 466.

[24]Li RK，Mickle DA，Weisel RD，et al. Optimal time for cardiomyocyte transplantation to maximize myocardial function after left ventricular injury[J]. Ann Thorac Surg，2001，72(6)：1957- 1963.

[25]Janssens S，Dubois C，Bogaert J，et al. Autologous bone marrow-derived stem-cell transfer in patients with ST-segment elevation myocardial infarction：double-blind，randomised controlled trial[J]. Lancet，2006，367(9505)：113- 121.

[26]Hofmann M，Wollert KC，Meyer GP，et al. Monitoring of bone marrow cell homing into the infarcted human myocardium[J]. Circulation，2005，111(17)：2198- 2202.

[27]Clifford DM，Fisher SA，Brunskill SJ，et al. Long-term effects of autologous bone marrow stem cell treatment in acute myocardial infarction：factors that may influence outcomes[J]. PLoS One，2012，7(5)：e37373.doi:10.1371/journal. pone.0037373.

[28]Zhang SN，Sun AJ，Ge JB，et al. Intracoronary autologous bone marrow stem cells transfer for patients with acute myocardial infarction：a meta-analysis of randomised controlled trials[J]. Int J Cardiol，2009，136(2)：178- 185.

[29]Zhang C，Sun A，Zhang S，et al. Efficacy and safety of intracoronary autologous bone marrow-derived cell transplantation in patients with acute myocardial infarction：insights from randomized controlled trials with 12 or more months follow-up[J]. Clin Cardiol，2010，33(6)：353- 360.

[30]Wollert KC，Meyer GP，Lotz J，et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction：the BOOST randomised controlled clinical trial[J]. Lancet，2004，364(9429)：141- 148.

[31]Lee JW，Lee SH，Youn YJ，et al. A randomized，open-label，multicenter trial for the safety and efficacy of adult mesenchymal stem cells after acute myocardial infarction[J]. J Korean Med Sci，2014，29(1)：23- 31.

[32]Gao LR，Pei XT，Ding QA，et al. A critical challenge：dosage-related efficacy and acute complication intracoronary injection of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction[J]. Int J Cardiol，2013，168(4)：3191- 3199.

[33]Meyer GP，Wollert KC，Lotz J，et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction：eighteen months’ follow-up data from the randomized，controlled BOOST(Bone marrow transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration)trial[J]. Circulation，2006，113(10)：1287- 1294.

[34]Rodrigo SF，van Ramshorst J，Hoogslag GE，et al. Intramyocardial injection of autologous bone marrow-derived ex vivo expanded mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction patients is feasible and safe up to 5 years of follow-up[J]. J Cardiovasc Transl Res，2013，6(5)：816- 825.

[35]Freyman T，Polin G，Osman H，et al. A quantitative，randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction[J]. Eur Heart J，2006，27(9)：1114- 1122.

[36]Lalu MM，Mclntyre L，Pugliese C，et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells(SafeCell)：a systematic review and meta-analysis of clinical trials[J]. PLoS One，2012，7(10)：e47559.doi:10.1371/journal. pone. 0047559.

·综述·

Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Myocardial Infarction

LIU Jin-feng，LING Bin

Department of Intensive Care Unit，the 4th Affiliated Hospital，Kunming Medical University，Kunming 650051，China

Corresponding author：LING BinTel：0871- 65156650，E-mail：lingbin02@yahoo.com

ABSTRACT：Bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs)have the ability to regenerate myocadial tissue. BMSCs transplantation can produce cardiac-like cells，promote angiogenesis，and secrete a variety of growth factors and cytokines. This article summarizes the molecular mechanisms of myocardial repair，explores the potential regenerative capacity of cardiac muscles after myocardial infarction，and reviews the previous studies on BMSC transplantation for treatment of cardiac muscle after myocardial infarction，with an attempt to provide new insights in clinical decision-making.

Key words：bone marrow-derived mesenchymal stem cells；myocardial infarction；stem cell transplantation

收稿日期：(2014- 08- 13)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.020

中图分类号:R541

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2015)01- 0108- 05

通信作者：凌斌电话：0871- 65156650，电子邮件：lingbin02@yahoo.com

基金项目：国家自然科学基金(81360289)和云南省应用基础研究计划项目(40212060)Supported by the National Nature Sciences Foundation of China(81360289)and the Basic Research for Application Plan Project of Yunnan(40212060)