循环微小核糖核酸在急性冠状动脉综合征中的应用与进展*

李忠佑综述，陈红审校

循环微小核糖核酸在急性冠状动脉综合征中的应用与进展*

李忠佑综述，陈红审校

循环微小核糖核酸（miRNAs） 是一类在血液中稳定存在的小分子，具有组织特异性，广泛参与体内生理与病理过程的调控，在疾病状态下可呈现其独特的表达谱。循环miRNAs获取容易，加之其独特的生物学特性而使其成为理想的候选生物标志物。目前，已经证实在急性冠状动脉综合征中，循环miRNAs可较传统标志物更早出现增高，且特异性更优，并可鉴别心力衰竭等临床情况导致的心肌损伤。另外，循环miRNAs还可能用于预示患者斑块的稳定性。通过改进检测策略及结合生物信息学技术，其对ACS的临床诊断效能可再获得提升。循环miRNAs是未来潜在成为预警及诊断ACS的理想生物标志物。

生物标志物；循环miRNAs；急性冠状动脉综合征；急性心肌梗死

急性冠状动脉综合征（ACS）的诊断策略中，循环生物标志物是不可或缺的关键指标。自上世纪90年代，肌钙蛋白（cTn）由于其突出的稳定性、敏感性及特异性而成为ACS定义与分型的核心标志物。然而，cTn的局限性也不容忽视，多种临床情况包括应激性心肌病、心力衰竭、心肌炎、肺栓塞或电除颤转复心律后均可能出现cTn升高；并且多种非心原性疾病包括严重肾功能衰竭、骨骼肌损伤等也可导致cTn的水平异常升高。此外，循环cTn最早需在心肌损伤4～6小时出现升高，滞后于早期诊断的需求。因此，研究者从未停止探索更为理想的ACS循环生物标志物。但是，现有的新型ACS生物标志物，如：缺血修饰白蛋白、C-反应蛋白、心型脂肪酸结合蛋白均未能替代及超越cTn。

近年来，循环微小核糖核酸（miRNAs）分子的发现，由于其良好的循环稳定性及与疾病高度相关的特性，使越来越多的研究者将目光聚焦于这类新型分子。因此，本文就miRNAs在ACS中的应用和进展做一综述。

1 miRNAs分子与其生物学功能

1993 年, Lee 等在秀丽隐杆线虫中发现了一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，以非编码蛋白的方式，通过产生一种小核糖核酸分子（RNA），作用于靶基因的特定区域来抑制其蛋白表达。随后，研究者先后在多个物种中发现了近百个这样的小RNA分子。国际上统一将这类小RNA正式命名为miRNAs，它是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA（～22nt），编码miRNAs的基因序列通常位于基因间或内含子区域。成熟的miRNAs分子通过碱基配对结合到靶mRNA 3’端的非翻译区，在转录后水平通过诱导靶mRNA降解、抑制翻译过程的起动以及多肽链的延长等方式抑制靶基因的表达。随着研究的深入，发现miRNAs在体内的基因表达调控发挥至关重要的作用，参与许多人体中关键的正常生理过程，例如生长发育、器官形成、细胞增殖与凋亡、免疫反应等环节。

目前，人体中已确认miRNAs数目达1600余种。每一个miRNA可以调控多个靶基因，反之，一个靶基因也可同时被多个miRNAs调节。miRNAs在人体内发挥着超乎想象的作用，miRNAs序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其可能作为蛋白质编码mRNA强有力的调节子。保守估计，约30%～50%的人类蛋白编码基因受到miRNA的调控，而每个miRNA可能有200 个以上的靶基因[1]。至今，多种心血管疾病包括冠心病、心律失常、心力衰竭、心肌病等均先后发现在疾病状态下miRNAs的存在表达变化，并参与了疾病调控的现象[2]。

2 循环miRNAs来源与特点

miRNAs在血清中的稳定存在，而不被含量丰富的核糖核酸酶（RNase）降解，这是由于大部分miRNAs以多种脂质囊泡的形式存在于循环中，主要为直径100 ～1000 nm的微囊泡[3]。这些脂质囊泡表面具有来源细胞的跨膜蛋白及受体，在生理与病理状况下细胞激活后通过胞吐的形式分泌至循环中。正是由于miRNAs的来源特性，循环中的miRNAs表达变化与疾病状态密切相关，在病理状态下呈现特征性的表达谱。牛津大学的Lawrie等[4]首先揭示此现象，发现B细胞淋巴瘤患者的血清中miR-155、miR-210及miR-21表达增高，而且miR-21的水平与患者无复发生存率相关。前列腺癌的患者几乎均可测得miR-141的表达增加，具有100%的特异性[5]。外周血可获得性的简易便捷，使这些发现开拓了循环miRNAs作为生物标志物临床实际应用的广阔前景。另外，miRNAs在体内的分布具有细胞与组织特异性，细胞损伤裂解后循环miRNAs变化非常显著。Wang等[6]发现大鼠中的循环miR-122在肝损伤时升高500倍。同理，心肌高度特异表达miRNAs在出现损伤时也同样可释放入循环中[7]。miRNAs既是一种发挥重要作用的“内分泌”因子，也是反映体内生理

及病理状态的生物标志物。

一些学者对循环miRNAs的稳定性以严格的物理及化学条件进行了检测。Chen等[8]在提取细胞的RNA后随即扩增一些miRNAs，经RNase处理3小时后仍然可以检测到半数以上的miRNAs，而对照的大分子RNA包括18s及28s的RNA、U6-SnRNA则已大部分被降解。将血清中的循环miRNA在苛刻环境中，如：反复冻融10次、极端酸碱度、去氧核醣核酸酶（DNase）处理3小时，miRNAs可耐受而其他对照RNAs大多数也已被降解。Mitchell等[9]将血浆在室温中放置24小时及反复冻融8次，也证实其对血浆中内源miRNAs分子几乎没有影响。

目前，研究已经证实miRNAs参与调控ACS中动脉粥样硬化与易损斑块的多个环节，同时由于其良好稳定的理化性质与高度心肌组织特异性，促使miRNAs最可能成为诊断ACS的新型理想生物标志物。

3 循环miRNAs作为急性冠状动脉综合征新一代生物标志物

3.1 ACS中miRNAs水平变化的时间进程

miR-208a最先被证实在心肌细胞中独有地表达，心肌肌球蛋白（α-myosin）重链基因（MYH7）为其宿主基因；miR-1、miR-133a/b、miR-208b和miR-499则同时富含于心肌及骨骼肌细胞。生理情况下，上述miRNAs在循环中的水平极低或者不存在。2009年，Ji等[7]在小鼠中首次揭示，以异丙肾上腺素诱导心肌损伤后的6小时及12小时，可测及miR-208a协同cTn显著升高。随后，我国学者Wang等[10]在急性心肌梗死（AMI）的小鼠模型中，发现结扎冠状动脉的手术组小鼠，在术后1小时就出现miR-208a水平升高，并在3小时后达到高峰；而假手术组小鼠血液中并未能测及miR-208a。同时，课题组还发现血浆miR-1、miR-133a、和miR-499在术后升高并在6小时达到高峰。Cheng等[11]应用相同的动物模型，发现小鼠在AMI后6小时miR-1水平较基线增高达200倍，直至3天后恢复正常，且其增高幅度与梗死面积呈正性相关。D'Alessandra等[12]证实了上述的实验结果具有可重复性，并提示miR-499较其他几种miRNAs在AMI后较晚出现升高，需在24小时后达到高峰。然而，miR-499具有高度敏感性，其循环中的水平与cTn具有良好的平行关系。Gidlӧf等[13]进而使用猪作为研究模型，发现冠状动脉闭塞40分钟后，循环中就可测及miR-1、miR-133a、miR-208a/b升高，但未能检出miR-499。对动物模型再灌注成功后20分钟，上述miRNAs除了miR-208a外均出现显著升高。循环中miR-1、miR-133和miR-208b在2小时达到高峰，在随后2.5小时减少了25%～50%，而miR-499则呈现持续性升高的表现。

D'Alessandra等[12]首先在人体中进行了验证，ST段抬高型心肌梗死（STEMI） 的患者接受再灌注治疗后，其miRNAs谱的变化相似于动物模型，miR-499水平上升的时间较晚，在STEMI后24小时左右达到高峰，而miR-1、miR-133a/b在AMI诊断时[T=（156±72）min]就与cTn同样呈现显著增高。Adachi等[14]对ACS患者在末次症状后的48小时检测血浆miR-499，结果全部AMI患者呈现升高，出院前恢复至正常水平，而不稳定型心绞痛（UA） 的患者，循环中从未被检出miR-499。

综上可见，miR-1、miR-133a/b、miR-208a/b、miR-499是心肌损伤敏感的生物标志物，较cTn具有早期快速升高的优势，且水平与cTn呈现变化趋势一致的曲线。

3.2 miRNAs在小型ACS队列中的应用

Wang等[10]发现AMI患者血浆中miR-1、miR-133a、miR-208a、miR-499显著增高，Gidlӧf等[13]在25例STEMI的患者中获得了同样的结果，并观察到循环中上述miRNAs可能经肾清除。D'Alessandra等[12]在33例STEMI患者中重复实验，虽然获得同上述结果异常升高的一组miRNAs，却未能在循环中检测出miR-208a/b。Wang 等[15]对53例ACS患者展开研究，发现miR-328也具有预测及诊断AMI的效能。另外，Wang等[10]的研究还首次评价了循环miRNAs应用于诊断AMI的效能，全部33例患者出现症状后4小时，血浆中可100%检出miR-208a，而仅有85%的患者出现cTn增高，证实前者敏感性更优。Crosten等[16]的研究在32例患者中发现，AMI后12小时血浆miR-208b和miR-499水平增高幅度高达1600倍和100倍，其受试者工作特征曲线（ROC）下面积分别为0.94和0.92。我国学者Li等[17]近期对67例AMI患者在发病12小时内留取血浆检测miR-1、miR-133a、miR-208b及miR-499，结果所有4个miRNAs水平较健康对照均有显著性增高，然而，遗憾的是随后的ROC分析，却未见任一miRNAs具有优于cTn的诊断效能。

Ren等[18]曾对miRNAs应用于早期预警ACS展开研究，通过高通量芯片筛查13例不稳定性心绞痛患者血浆中754个miRNAs，结果发现一组循环miRNAs包括miR-106b/25簇、miR-17/92a簇、miR-21/590-5p家族、miR-126及miR-451表达异常增高，并随后在45例患者中获得验证。范雪松等[19]也在ACS患者中发现，miR-21及miR-16的发生特异性表达变化。由于miRNAs的水平源于疾病状态下体内网络化影响与调控的结果，因此推测这些循环miRNAs具有预示不稳定性斑块的意义。

3.3 miRNAs在大型ACS队列中的应用

Devaux等[20]报告了迄今为止最大规模的队列研究，87例健康对照者中，血浆中miR-208b与miR-499近乎无法检出，然而在510例AMI患者中却显著增高。此两个循环miRNAs在STEMI患者中的平均水平高于非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）。在胸痛发作的3小时内，miR-499在93%的患者中呈阳性，而高敏肌钙蛋白T（hs-TnT）稍逊，仅在88%的患者中呈阳性，但是二者差异无统计学意义（P=0.78）。无论如何，miR-499具有不劣于hs-TnT的诊断效能，二者ROC下面积同为0.97。Ai等[21]发表的另一个大型研究队列中，重复证实93例AMI患者miR-1和miR-133显著升高。德国学者Widera等[22]首次观察了循环miRNAs对ACS预后的影响，444例ACS患者中， AMI患者血浆中miR-1、miR-133a和miR-208b水平显著高于不稳定性心绞痛，长达6个月的随访后发现，经校正年龄、性别后的单因素分析提示，miR-133a和miR-208b的水平与ACS患者死亡呈正相关。

Olivieri等[23]的研究结果非常令人鼓舞，对92例高龄[平均年龄（82.6±6.9）岁]并伴有充血性心力衰竭（CHF）的NSTEMI患者检测了血浆中的miR-1、miR-21、miR-133a、miR-208a、miR-499，相较于健康对照的高龄者，NSTEMI患者中miR-499增高80余倍；对比单纯CHF患者，miR-499的水平也具有显著差异。同时，miR-499无论对比cTn或者hs-TnT，在高龄患者中用于诊断NSTEMI更具优势（ROC下面积分别为 miR-499=0.86，cTnT=0.68，hs-cTnT=0.70），而

不受患者是否合并CHF的影响。在临床实践中，还有多种情况如：肺栓塞、肾功能不全、重症感染等经常限制了cTn的诊断特异性，NSTEMI又由于缺乏典型临床症状与心电图改变而导致医生面临诊断困境，循环miRNAs或许有望可在这部分患者中发挥关键的鉴别诊断效用。

3.4 循环miRNAs作为ACS标志物的改进策略

上文述及的研究中，均以血浆作为循环miRNAs的检测标本，然而循环中多种细胞与成分均具有含量丰富的miRNAs，包括白细胞、红细胞、单核细胞、血小板、外来体、微囊泡等。同时，心肌细胞损伤及坏死后miRNAs释放入血液，仅是ACS患者循环miRNAs的部分来源，体内多种机制如：炎症、血小板活化、内皮损伤、氧化应激均可对miRNAs表达谱产生影响，而现有研究却大多数延续传统思路，仅关注于前者来源的miRNAs。因此，以全血检测循环miRNAs，将更全面涵盖及更早期反映疾病的特征性miRNAs表达谱，也更可能捕获尚在研究者视野外的理想miRNAs标志物。

Meder等[24]验证了此项设想，它们对20例STEMI进行了全血miRNAs谱筛查，发现共有121个miRNAs表达上调，而76种miRNAs呈现下调，而本文前述中主要研究的miRNAs均不是表达差异最显著的20个miRNAs。本研究中全血样本均在发病后3小时内采样，其中miR-1291与miR-663b是预测AMI价值最高的miRNAs（ROC下面积分别为0.91及0.94）；而miR-30c与miR-145则可有效预估心肌梗死面积。另外，倘若将表达差异最显著的20个miRNAs组合，共同用于预测AMI，其敏感性可达到90%，特异性高达96%，而准确度为93%，ROC下面积提升至0.99。此研究大幅提升了循环miRNAs作为ACS标志物的潜力，并进一步拓展了循环miRNAs的研究方向与应用前景。

4 存在的问题与展望

综上所述，尽管循环miRNAs具有高度敏感与特异性，并且具备早期预警与诊断ACS的优势，但是，转化应用于临床仍旧存在如下问题：①部分循环中miRNAs的浓度较低，不易检出，将造成临床检验标准化与精确定量的困扰；②目前循环miRNAs的检测有赖于相对复杂的实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）或者miRNAs芯片技术，尚无法突破其对快速及早期诊断的临床应用限制；且不同的PCR检测平台存在热动力学偏倚，难以避免检测误差；③不同类型的循环miRNAs检测样本将显著影响miRNAs的水平，而现阶段研究尚缺乏样本的标准化处理与检测的规范。

无论如何，由于循环miRNAs的特性与优点，其有望成为新型ACS生物标志物，甚至可能为药物治疗提供全新的分子靶点，从此改变传统的ACS诊疗模式。

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2014-11-19）

（编辑：汪碧蓉）

国家自然科学基金（81270274）；北京市科技计划项目（D14110700300000）；中央保健专项资金科研课题（W2013BJ54）作者单位：100044 北京市，北京大学人民医院 心脏中心

李忠佑 住院医师 博士 主要从事动脉粥样硬化的临床与基础研究 Email:ayulee9@126.com 通讯作者：陈红

Email:chenhongbj@medmail.com.cn

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1000-3614( 2015 )02-0190-03

10.3969/ j. issn. 1000-3614. 2015.02.024