不同剂量酒精干预脑缺血动物模型的研究进展

李锦程，赵海苹，罗玉敏

（首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京 100053）

不同剂量酒精干预脑缺血动物模型的研究进展

李锦程，赵海苹，罗玉敏

（首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京 100053）

酒精与脑缺血发生和预后都密切相关，用不同动物模型研究酒精与脑缺血的关系得出的结果不尽相同。本文总结了目前常用的酒精干预脑缺血动物模型的制作方法，并对模型的优缺点进行评价，为酒精干预脑缺血研究中动物模型的选择提供参考。

酒精；脑缺血；脑卒中；模型，动物

有研究表明：饮酒与脑缺血相关［1，2］。Patra等分析发现：与不饮酒的男性相比，每天饮酒35 g以下能降低男性缺血性卒中的死亡风险，每天饮酒12 g时死亡风险最低；对于女性，每天饮酒44 g以下能降低缺血性脑卒中的死亡风险，死亡风险最低的女性每天饮酒少于12 g；男性每天饮酒少于37 g或女性每天饮酒少于46 g，缺血性脑卒中的发病风险下降；每天饮酒12杯（每杯约含酒精12 g），缺血性脑卒中的发病风险最高（以上酒的克数指纯酒精含量）［1］。动物模型研究也表明酒精与脑缺血关系密切［3，5，19］。由于实际操作中伦理等方面的各种限制，研究酒精对脑缺血的作用不能在人体进行，动物模型便成为研究替代工具。目前酒精干预脑缺血主要使用大鼠、小鼠、沙鼠制作动物模型，研究者根据实验目的采用不同的酒精给予方式、剂量、给予时间、持续时间，采用不同的脑缺血方法。本文综述了以往研究使用过的酒精干预脑缺血模型，并对模型的优缺点进行评价。

1 大鼠模型

使用大鼠造模的实验中，主要应用的是Wistar和Sprague-Dawley雄性大鼠，Wistar大鼠体重大多在（180～320）g，Sprague-Dawley大鼠体重范围大多在（230～300）g。

1.1 Wistar大鼠

应用Wistar大鼠的研究，酒精干预均在脑缺血之前。Favalli等［3］把10％v/v的酒精作为唯一的饮品，持续给予大鼠28 d。为研究不同时期酒精的作用，分别在给予酒精28d时或停止给酒精后24 h用光化学诱导血栓形成的方法造成大脑额顶叶皮质缺血，观察缺血的额顶叶皮质区谷氨酸的释放。采用Montalbetti［4］等使用过的光化学联合微透析的方法，发现饮酒28 d能轻微减少缺血后谷氨酸的释放，但并不减轻脑损伤；而停止饮酒24 h的大鼠缺血后脑损伤更重，同时谷氨酸和天门冬氨酸释放增加。用类似方法，研究［5］发现缺血前1.5 h腹腔注射1.5、3.0 g/kg酒精能显著减少局灶性脑缺血后谷氨酸的释放，但不能显著减轻脑损伤。

这种模型适于研究酒精对血小板、血栓形成的影响，而且此模型不需要开颅，动物存活时间长，适于慢性酒精联合脑缺血研究；此外，皮层梗塞部位可任意选择，为研究酒精对特定部位皮层缺血的影响提供了条件。但它与人类常见的脑栓塞存在差异，是动脉永久性闭塞，不能观察酒精对脑血管再通后的影响。

吴光、金鲜花等［6，7］研究长期饮酒大鼠脑缺血后血浆降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、神经肽Y（neuropeptide Y，NPY）、内皮素（endothelin，ET）水平的变化。把95％的医用酒精配制成7.2％的酒精，供大鼠代水自由饮用100 d。线栓法制作局灶性脑缺血模型，缺血前、缺血后1、3、6 h左心室取血测定血浆CGRP、NPY、ET，发现长期饮酒可使脑梗死超早期血浆CGRP降低、NPY和ET升高。他们研究长期饮酒大鼠缺血脑组织中Fas-L抗原表达［8］时，使用（250～320）g大鼠，造模方法与以上大致相同，不同之处为酒精代水自由饮用时间为12周，结果发现长期饮酒使缺血后Fas-L阳性表达高峰提前。

以上实验均用酒精代水使动物自由摄入，有可能造成摄入酒精量之间的差别，从而影响实验结果。

1.2 Sprague-Dawley大鼠

1.2.1 脑缺血前酒精干预：用未禁食或禁食一夜的大鼠研究酒精对局部脑缺血的急性作用，包括对大脑水肿和脑内钠、钾离子含量的影响。用5％的葡萄糖配制成20％或30％的酒精，左侧大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）前1 h腹腔注射酒精2 g/kg或3 g/kg，缺血持续4 h后取脑测定水和离子含量。研究表明2 g/kg酒精增加未禁食大鼠脑水肿和脑内钠离子含量，酒精的这种神经毒性作用可能与升高血糖有关［9］。在禁食一夜的大鼠，腹腔注射酒精联合脑缺血后没有出现血糖升高，3 g/kg剂量的酒精加重大鼠脑水肿，2 g/kg剂量的酒精不加重脑水肿，且3 g/kg酒精的神经毒性作用与血糖浓度无关［10］。

也有学者使用大鼠全脑缺血模型研究酒精对脑缺血-再灌注损伤后的影响［11，12］。单边侧脑室注射0、2.0、8.0、12.0、16.0、18.0或20.0 mg/kg的酒精（100％，溶于水，40％v/v）。缺血前20 min第一次注入酒精，间隔24 h，共注射3次。使用立体定位注射器以0.5 μL/min的速度注入酒精，注入10 min后，以1 mm/min的速度拔出注射器，缝合切口。缺血15 min再灌注3或5d。发现8.0-12.0 mg/kg酒精能激活红藻氨酸（kainate，KA）受体中的Gluk1，促进依赖 Ca2+的 γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）释放，激活突触后GABAA受体，抑制 c-Jun氨基端激酶3（c-Jun N-terminal kinase 3，JNK3）凋亡通路，发挥神经保护作用。

Zhao等［13］发现尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD（P）H）氧化酶在长期饮酒加重缺血脑损伤中有重要作用。他们使用（200～220）g大鼠，流质酒精饮食（Dyets，Bethlehem，PA）8周。流食中乙醇含量为6.4％v/v，食物热量为1.0 kcal/mL，其中35％来自脂肪，11％来自碳水化合物，18％来自蛋白质，36％来自乙醇；有数据表明，这种饮食时大鼠血液中酒精浓度大约为20 mmol/L［14］。8周后阻塞大脑中动脉2 h、再灌注24 h引起脑损伤。也有学者用同样的模型研究过长期饮酒对短暂性脑缺血后脑损伤的影响［15］，发现酒精减弱缺血过程中局部脑血流的反弹性增加。研究长期饮酒对大脑缺血/再灌注损伤影响的剂量依赖性时，Zhao等同样使用此模型，1.0 kcal/mL的流质饮食中含1、3、5或6.4％（v/v）酒精，给予非酒精饮食组、1、3或5％（v/v）酒精饮食组的每日饮食量以6.4％（v/v）酒精饮食为基准［16］，1％酒精减小梗塞体积，6.4％酒精增大梗塞体积，3％或5％酒精对梗塞体积无明显影响。以上模型酒精的干预均在脑缺血之前，模拟了长期饮酒的脑血管病的发生状况，可以选择此类模型研究临床中不能完成的机制研究。

1.2.2 脑缺血之后酒精干预：Wang等［17］用管腔内线栓阻断模型研究脑缺血后急性酒精干预的神经保护作用，使用（280～300）g大鼠。为研究不同剂量酒精的作用，把0.5、1.0或1.5 g/kg剂量的酒精用生理盐水稀释成3 mL，于灌注开始时腹腔注射，再灌注48 h后测定脑梗死体积，发现：与给予生理盐水相比，1.5 g/kg酒精能把梗塞体积减小47％，1.0 g/kg能减小23％，0.5 g/kg没有减小梗塞体积；为探究治疗时间窗，于MCAO后2、3、4 h腹腔注射1.5 g/kg剂量的酒精，再灌注48 h后测定脑梗塞体积，发现MCAO后4 h给予酒精仍能减小梗塞，改善神经功能；为研究酒精与低体温是否有协同叠加的神经保护作用，MCAO后90 min向大鼠全身喷洒酒精将大鼠核心体度降至（32～33）℃，MCAO 2 h后停止喷酒精且大鼠自动恢复体温与此同时腹腔注射1.5 g/kg酒精，发现酒精与低体温没有叠加的神经保护作用；酒精没有促进缺血性中风时的脑出血，另外，在缺血性中风时，酒精不增加重组组织型纤溶酶原激活剂（recombinant tissue-type plasminogen activator，rtPA）或尿激酶（urokinase，UK）应用后的脑出血；缺血后2 h给予1.5 g/kg酒精，再灌注 3 h测定低氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1，HIF-1α），发现 HIF-1α增加。有研究还表明［18］，常压氧（normobaric oxygenation，NBO）联合酒精对脑缺血有协同神经保护作用，MCAO 2 h后，于再灌注开始时腹腔注射1.0 g/kg酒精（用生理盐水稀释成3ml），然后给予2 h常压氧（95％O2），这种保护效应可能与ADP/ATP比例、活性氧、NADPH氧化酶活性降低，丙酮酸脱氢酶活性增强有关。Zeng等［19］在MCAO 2 h后，于灌注开始时腹腔注射1.5 g/kg酒精，再灌注24 h测脑水肿、再灌注48 h观察血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的完整性，发现酒精能减轻脑缺血-再灌注后的脑水肿和BBB破坏，可能与酒精减少基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和水通道蛋白（aquaporin，AQP）有关。

总之，在制备酒精干预脑缺血模型中，脑缺血2 h MCAO/24 h、48 h再灌注模型使用较多。Sprague-Dawley大鼠是制备酒精干预脑缺血模型中最常用的动物。长期饮酒后脑缺血最符合人类发病顺序的模型。

2 小鼠（C57BL/6和C57BL/6J）模型

在小鼠模型的研究中，研究者多使用2月龄小鼠，且酒精均在脑缺血之前给予。Wang等［20］研究酒精预处理（ethanol preconditioning，EtOH-PC）减轻脑缺血-再灌注后白细胞-内皮细胞粘附和迟发性神经元死亡与 Ca+激活的 K+（calcium-activated potassium，BKCa）通道激活有关。用［体重（g）× 0.6+0.3］计算95％酒精给予量（μL），用无菌蒸馏水把酒精稀释成0.3 mL，在缺血前24 h灌胃。因为EtOH-PC的早期（1～2 h后）脑保护作用弱于晚期（24 h后），所以选择在酒精预处理后24 h进行脑缺血-再灌注。夹闭双侧颈总动脉（common carotid arteries，CCA）20 min造成脑缺血。再灌注2 h和3 h后测定软膜小静脉中滚动的白细胞和粘附的白细胞的数量，再灌注4 d后观察海马区DND、凋亡和胶质细胞激活。

Sun等［21］研究低剂量饮酒可能通过上调过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，PPARγ）减轻小鼠短暂性局灶脑缺血损伤。采用的也是流质1％（v/v）酒精（Dyets，Bethlehem，PA）饮食8周，饮食所含能量为1.0 kcal/mL，其中35％来自脂肪，18％来自蛋白质，42％来自碳水化合物，5％来自乙醇。酒精饮食后0.5、1、2、4 h血液酒精浓度分别为0.8、1.0、0.5、0 mM。线栓法制备MCAO，缺血90 min再灌注24 h后观察脑梗死、DNA断裂和核PPARγ蛋白/活性。

目前，使用小鼠（C57BL/6和C57BL/6J）研究酒精和脑缺血的关系，优势在于多数转基因为小鼠（C57BL/6和C57BL/6J），可以用于特定基因功能方面的研究。但缺血性脑卒中在老年人中较为常见，这些实验使用的小鼠年龄偏小。

3 沙鼠模型

在沙鼠模型的研究中，酒精干预也在脑缺血之前，沙鼠体重大多在（50～80）g，且研究者基本采用阻塞双侧CCA 5 min制备短暂全脑缺血模型。Xia等将酒精以22.5％（w/v）的浓度混合于奶粉中，用4 g/kg灌胃35d。35 d后，夹闭双侧CCA 5 min，再灌注48 h。发现酒精没改变海马CA1区缺血后1，4，5-三磷酸肌醇受体（inositol 1，4，5-triphosphate receptor，IP3R1）mRNA、肌质网或内质网Ca2+-ATP酶（sarcoplasmic or endoplasmic Ca2+-ATPase， SERCA2b）mRNA的下降［22］。

McCrea等把1 g/kg或4 g/kg酒精与生理盐水混合成1 mL，皮下注射，持续21 d。停止注射酒精9 d，使动物恢复体重。之后阻塞双侧CCA 5 min造成脑缺血，发现酒精减少谷氨酸释放，而再灌注1月后发现酒精没改变沙鼠脑缺血后的组织学和神经行为学结局［23］。该团队同样采用皮下注射1 g/kg或4 g/kg酒精，酒精注射后1 h后阻塞双侧CCA 5 min造成脑缺血，通过水迷宫实验和观察术后1月纹状体、海马、丘脑等的病理改变，发现急性酒精干预不能改变短暂性脑缺血-再灌注后的结构和功能变化［24］。Phillis等在缺血前30 min给予沙鼠腹腔注射1.02 g/kg（即22 mmol/kg）乙醇（与盐水以6：5混合），后阻塞双侧CCA造成全脑缺血5 min，再灌注5d后发现海马CA1锥体神经元损失减少［25］。

酒精干预全脑缺血模型时，沙鼠比大鼠死亡率低［26］，为避免高死亡率使用沙鼠造模更合适。但是，由于沙鼠脑部血管发育存在个体差异，阻断双侧CCA半小时以上，仅30％左右的沙鼠会出现脑缺血，因此，如果进行更长时间的脑缺血研究，模型可靠性大大降低［27］。

4 小结

由于种属差异的存在，酒精干预脑缺血动物模型不能完全模拟人类的发病状况。有实验表明Sprague-Dawley大鼠每千克体重能够比人耐受更多酒精，所以动物模型的酒精剂量-效应关系不能直接应用于人［10］。除种属差异外，脑缺血在人群发病与年龄和性别有很大关系，而大多数实验使用雄性、青壮年动物，忽略了性别、年龄的影响。而且，人类饮酒不可能像实验动物一样有规律，缺血性脑卒中发作后的缺血持续时间也不相等，相应模型难以准确模拟人类发病。另外，麻醉也影响动物生命体征。同时，人类脑缺血发病与遗传、环境、生活习惯、疾病状况等多种因素有关，这些因素都很难在动物身上得到再现。

综上所述，应用于酒精干预脑缺血研究的啮齿类动物模型有很多，不同的动物模型各具特点，理想的动物模型是研究疾病发生机制和药物开发的关键，所以应综合考虑种属差异、个体差异以及研究目的等因素建立合适的酒精干预脑缺血动物模型。

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Research progress of alcohol intervention in cerebral ischemia animal models

LI Jin-cheng，ZHAO Hai-ping，LUO Yu-min
（Cerebrovascular Diseases Research Institute，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China）

Alcohol is closely related to the occurrence and prognosis of cerebral ischemia.Researches on the relationship between alcohol and cerebral ischemia using different animal models draw different conclusions.This paper summarizes the common alcohol intervention methods in making animal models of cerebral ischemia，and evaluates the advantages and disadvantages of these models to provide reference for the future research.

Alcohol；Cerebral ischemia；Stroke；Models，animal

R33

A

1671-7856（2015）04-0070-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.014

国家自然科学基金项目（81471340，81401090）。

李锦程（1991-），女，硕士生在读，神经病学专业。Email：lijinchengsmile@163.com。

罗玉敏，女，研究员，博士生导师，研究方向：脑血管病。Email：yumin111@ccmu.edu.cn。

2015-02-10