斑马鱼模型在药物非临床毒代动力学研究中的应用

赵琪，汪溪洁，马璟

（中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海201203）

斑马鱼模型在药物非临床毒代动力学研究中的应用

赵琪，汪溪洁，马璟

（中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心，上海201203）

斑马鱼是一种简单的生物实验动物，拥有和哺乳动物相似的生物结构与生理功能。斑马鱼模型在药物毒代动力学的研究应用前景十分广阔，采用斑马鱼模型研究药物在体吸收、分布和代谢过程，能够减少实验研究的假阴性或假阳性结果，提高实验准确性；采用斑马鱼模型进行一般毒理学实验的毒代动力学研究，有助于一般毒理学实验研究的剂量选择和靶器官确定；采用斑马鱼模型进行生殖与发育毒性实验的毒代动力学研究，可以提高生殖与发育毒性实验的预测性。本文主要就以上几个方面对药物在斑马鱼体内的吸收、分布和代谢过程以及该模型在药物非临床毒代动力学中的应用进行论述。

斑马鱼；药物；毒代动力学

担尼系斑马鱼（Danio rerio；zebrafish）是辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Brachy danio）的一种热带淡水鱼［1］。1981年Streisinger等［2］首次采用斑马鱼进行实验研究，建立了斑马鱼体外受精技术和单倍体诱导技术等实验技术。之后Kimmel等［3］对斑马鱼的胚胎发育过程进行了研究，这些工作为斑马鱼作为脊椎动物模式生物应用与实验研究奠定了基础。1996年，Nusslein-Volhard［4］使用斑马鱼进行了大规模的诱变筛选。斑马鱼模型最初因其胚胎适用于水体毒素的毒性评价而得到毒理学的关注，之后被广泛应用于心脏毒性、肝毒性、神经毒性及发育毒性实验研究。随着斑马鱼模型在新药筛选中的不断应用，药物在斑马鱼体内靶器官浓度的测定及其体内代谢过程越来越重要。本文主要就药物在斑马鱼体内的吸收、分布和代谢过程以及该模型在药物非临床毒代动力学中的应用进行综述。

1 斑马鱼生物特征

斑马鱼作为一种理想的生物模型，具有体型小、繁殖快、易于饲养等特点。成年斑马鱼体长仅4～5 cm，3 L大的鱼缸可养殖20～30尾成鱼［5］，可在有限的空间内养殖相当大的群体，保证样品供应。斑马鱼饲养成本仅为啮齿动物的0.11%～1%［5］，与哺乳动物实验相比，实验费用低、周期短、所用化合物量少。斑马鱼模型比哺乳动物模型简单，但其生物结构和生理功能与哺乳动物高度相似，且基因组学研究发现，其基因与人类基因87%相似［6］。同时大量的研究证实，斑马鱼对包括酶诱导和氧化应激反应在内的毒性反应机制与哺乳动物惊人地相似［7］，适合用于毒代动力学研究。

2 药物在斑马鱼体内的吸收、分布及代谢过程

2.1 吸收

斑马鱼模型实验研究常采用水暴露给药，化合物经胃肠道系统吸收以及皮肤和鱼鳃的被动扩散进入斑马鱼体内。化合物在不同组织器官中的吸收程度影响对化合物毒性的评价，药物可能会因为吸收不良或过量吸收导致假阴性或假阳性结果。在斑马鱼发育的前5 d，包括生命早期阶段，受精后24 h（24 h post fertilization，24 hpf），对生物样品进行重复测定，可整体分析斑马鱼胚胎的吸收动力学［8］。Berghmansa等［9］研究了9种药物在斑马鱼的吸收情况，发现极性大的药物易吸收进入斑马鱼体内。给药后，极性较大的氯丙嗪、西沙比利和维拉帕米等药物在斑马鱼体内的浓度明显高于烟碱、阿司匹林、莫西沙星、异丙肾上腺素和克罗卡林等极性较小的药物。因此，研究药物在斑马鱼体内的吸收可以减少实验假阴性或假阳性结果。例如，哺乳动物实验发现，红霉素和D-索他洛尔可导致QT间期延长，但受精后3 d（3 days post fertilization，3 dpf）的斑马鱼幼体给予这两种药物后，未检测到其心率有显著性变化。生物分析研究显示，这两种药物在斑马鱼体内的吸收量仅为每幼体0.53和0.02 ng［10］，可以判定该结果为假阴性结果，需对这两种药物的心脏毒性做进一步研究。

2.2 分布与蓄积

药物在斑马鱼体内的分布和蓄积可以通过使用放射性标记化合物和定量全身放射自显影技术进行测定［11］。化合物在斑马鱼体内的分布与蓄积与在哺乳动物体内的分布与蓄积相似。研究发现，斑马鱼体内存在胎盘屏障，乙醇能够在胎盘绒毛蓄积，但很难进入胚胎［12］。此外，斑马鱼在3～8 dpf形成血脑屏障（blood-brain barrier，BBB），比如，在哺乳动物BBB渗透性差的丁溴东莨菪碱和氯雷他定，其在斑马鱼幼体头部的浓度明显低于其在斑马鱼幼体躯干部的浓度；可以跨越哺乳动物BBB的苯海拉明、氟哌啶醇和东莨菪碱在斑马鱼幼体的头部和身体均匀分布［13］。斑马鱼胚胎发育阶段出现的卵黄与身体的其余部分相比富含脂质，疏水化合物可能会成倍地富集在此处，从而影响其在斑马鱼体内的分布与蓄积，导致过高估计诱导器官毒性所需要的有效浓度，故应该测试去除卵黄是否会改变分析结果［14］。

2.3 代谢

药物的代谢产物也可以导致毒性的产生，了解化合物在斑马鱼的体内代谢对准确评价药物毒性具有重要意义。采用斑马鱼代替哺乳动物进行代谢研究，可以减少动物使用量，降低研发成本。斑马鱼体内能够发生与人类似的代谢，利于实验结果外推，可为临床实验研究提供参考。研究发现，斑马鱼可以进行Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应［15］。

2.3.1 斑马鱼Ⅰ相代谢反应

斑马鱼的Ⅰ相代谢反应主要包括氧化，N-去甲基化，O-去甲基化和N-脱烷基化等。不同种属的细胞色素P450（cytochromeP450，CYP）同工酶的组成会导致药物在不同种属动物和人体的代谢不同，与药物代谢相关的CYP酶主要为CYP1，CYP2和CYP3家族。斑马鱼具有人CYP1A1，CYP1B1，CYP2和CYP3A等亚型的同工酶。分析斑马鱼CYP1家族基因序列发现，斑马鱼Cyp1A的外显子结构与人类CYP1A1和CYP1A2相似，其Cyp1B1结构与人类CYP1B1也非常相似［16］。说明斑马鱼CYP1家族与人CYP1家族部分基因具有同源性。Alderton等［16］的研究发现，非那西丁在斑马鱼体内代谢为对乙酰氨基酚，证实了斑马鱼体内存在人CYP1A2同工酶。斑马鱼CYP2家族基因序列分析研究表明，斑马鱼Cyp2R1和Cyp2U1与人类CYP2直系同源［16］。研究发现，右美沙芬和布洛芬在斑马鱼体内分别代谢为右啡烷和羟基布洛芬，证实了斑马鱼体内存在人CYP2D6和2C8/9同工酶［15，17］。哺乳动物肝和小肠中的CYP蛋白大部分是CYP3A，它们参与内源性物质和外源性物质的广泛代谢，对于终止类固醇激素有重要作用。Tseng等［18］已证明斑马鱼体内的Cyp3A65与人类CYP3A亚族同源。斑马鱼幼体的肝在72 hpf完全形成并发挥作用，Cyp3A65分别于72 hpf和84 hpf在肝和肠中表达。斑马鱼给予地塞米松和利福平后，前肠部的Cyp3A65转录增加，这与地塞米松和利福平对人体CYP3A作用相似。

2.3.2 斑马鱼Ⅱ相代谢反应

斑马鱼的Ⅱ相代谢反应主要包括硫酸化和葡萄糖醛酸化，其中葡萄糖醛酸化反应是最主要的Ⅱ相代谢反应，葡萄糖醛酸转移酶（glucuronyltransferase，UGT）为其主要催化酶。Hu等［19］的研究发现，毛蕊异黄酮在斑马鱼体内的Ⅱ相反应代谢物与其在哺乳动物体内的Ⅱ相反应代谢物相同，表明斑马鱼体内存在人Ⅱ相代谢反应同工酶。研究人员发现并克隆了斑马鱼UGT的所有组成成分，发现斑马鱼有45个Ugt基因，分别为Ugt1，Ugt2和Ugt5家族，其中Ugt1和Ugt2基因和人类UGT1和UGT2基因的关联性较强［20］。Jones等［21］发现，给药（多氯联苯混合物后斑马鱼Ugt1A1基因表达上调，与人类UGT1A1反应一致，该结果进一步支持斑马鱼Ugt1A1与人类UGT1A1具有同源性。

3 斑马鱼模型在毒代动力学的应用

斑马鱼模型现已在新药安全性评价研究中广泛应用，开展斑马鱼毒代动力学研究有助于加强该物种体内外实验研究的发展和规范。在斑马鱼毒代动力学研究中，通常采用气质谱联用仪分析非极性化合物，液质联用仪分析极性化合物。

3.1 一般毒理学实验的毒代动力学研究

2013年，经济合作与发展组织（OECD）颁布了斑马鱼胚胎急性毒性实验指导原则，其中规定斑马鱼胚胎急性毒性实验主要评价斑马鱼胚胎接触化合物96 h后产生的急性毒性反应［22］。在急性毒性实验中对斑马鱼进行毒代动力学研究，有助于实验剂量选择和靶器官的确定，可以为后续实验提供参考数据。最近Brox等［23］采用高效液相色谱与质谱联用的方法对26种极性药物进行了急性毒性毒代动力学研究，他们同时报道了化合物在斑马鱼体内的3种不同的浓度-暴露时间曲线：斑马鱼接触氯贝酸后随时间增加体内浓度不断增加；斑马鱼接触赛克津24 h后体内浓度即达稳态；斑马鱼接触苯佐卡因24 h内体内浓度迅速增加随后逐渐减小。该研究为人们提供了大量的斑马鱼分析资料，极大地促进了斑马鱼毒代动力学研究。

OECD先后制订了鱼类14 d长期毒性实验和21 d鱼类内分泌活性物质检测实验的实验方法［24-25］，为进行斑马鱼重复给药毒性实验的毒代动力学研究奠定了基础。目前尚无研究机构对斑马鱼在重复给药毒性实验中的毒代动力学研究进行验证，随着斑马鱼模型在药物安全性评价研究的不断深入，该研究将会成为斑马鱼毒代动力学研究的新热点。

3.2 生殖与发育毒性实验的毒代动力学研究

目前，药物的生殖与发育毒性实验研究常采用怀孕大鼠或兔做实验模型，动物消耗量大，实验成本较高。体外生殖与发育毒性实验的临床预测性较差，虽然可以采用多种体外实验进行联合评价提高其临床预测性，但实验设计较为复杂，不利于操作。因此，许多研究人员开始使用斑马鱼模型进行生殖与发育毒性研究。斑马鱼的胚胎较小，母体外发育，发育时间短，采用该模型进行实验研究，操作简单，实验结果预测性较高。Hill等［26］对90种化合物进行斑马鱼发育毒性验证的研究发现，在哺乳动物实验中出现阳性结果的多数化合物，在斑马鱼实验中得到相同结果，结合生物分析结果，斑马鱼实验对所有化合物的总体预测性可达到为89%。Piersma等［27］对12种具有不同毒性作用机制的生殖毒性化合物进行了毒代动力学研究，其结果进一步支持了12种化合物的毒性效应实验，补充了毒理学研究中的一块空白，为其致毒机制研究提供了科学依据。而且他们提出在将来的实验研究中，毒代动力学研究可能会重新定义体外实验阳性结果的取舍。

近年来，国内斑马鱼模型在药物生殖与发育毒性的研究发展非常迅速。Chang等［28-29］建立了斑马鱼胚胎发育毒性模型评价方法，并采用已知胚胎毒性的9种化合物对该方法进行验证。结果显示，对乙酰氨基酚、甲硫咪唑、吲哚美辛、5-氟尿嘧啶及甲氨蝶呤，均呈现不同程度的致畸情况，表现为阳性结果，而抗坏血酸、异烟肼、青霉素G及糖精表现为阴性结果。实验结果与传统动物实验及临床表现一致。Meng等［30］首次提出建立基于斑马鱼模型的新药毒代动力学研究方法，希望能够利用斑马鱼开展生殖毒性伴随毒代动力学研究。

4 结语

斑马鱼具备完整的器官系统，拥有整体动物的生物复杂性能够提供广泛的代谢动力学分析，实验结果预测性明显优于体外实验，可以体现体内代谢的综合结果。采用斑马鱼模型进行实验研究可以弥补体外实验和哺乳动物实验之间的差异，减少哺乳动物的使用，体现减少、替代和优化（reduction，replacement，refinement，3R）原则。采用斑马鱼模型进行化合物毒性评价并跟踪考察化合物在斑马鱼模型体内的吸收、分布及代谢等情况，将会为后续的哺乳动物毒性实验研究提供更多有效信息。

目前，美国食品药物监督管理局（FDA）下设有3个斑马鱼药物毒理学评价实验室，斑马鱼资料数据库也已建立完备—斑马鱼信息网络（Zebrafish InformationNetwork，ZFIN，http：//www.zfin. org/），极大地促进了该模型在急性毒性、靶器官毒性、生殖毒性等实验中的应用。但是，斑马鱼模型的毒代动力学研究未进行大规模的联合验证，可用资料数据库相对较少，限制了其在药物毒性评价中的应用。完善ZFIN，增加斑马鱼模型毒代动力学研究的资料数据库，将大大促进斑马鱼模型在药物毒性评价中的应用。国内对于斑马鱼模型在毒代动力学的研究应用还处于初级阶段，基于斑马鱼模型的中药复杂体系的代谢研究也刚刚起步，许多实验方法还不够成熟，加快开展斑马鱼模型的毒代动力学研究将有助于药物毒性机制研究，有利于推动我国新药研发进程。

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Application of zebrafish in non-clinical drug toxicokinetics research

ZHAO Qi,WANG Xi-jie,MA Jing
(National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research,China State Institutes of Pharmaceutical Industry,Shanghai 201203,China)

Zebrafish shares similar biological structure and physiological functions with mammals and has been recognized as a simple biological test system.The application of a zebraf i sh model in drug toxicokinetics is gaining popularity.The study of drug absorption,distribution and metabolism reactions in zebraf i sh can reduce false negative or false positive results and improve the accuracy of experiments.Using the zebrafish model to study toxicokinetics in general toxicology experiments can help choose right dose and target organ.A zebrafish model used to study toxicokinetics in reproductive and developmental toxicology experiments can improve the predictability of the experiment.This review focuses on the process of drug absorption,distribution and metabolism in zebrafish,as well as the application of zebrafish models used in non-clinical drug toxicokinetics research.

zebrafish;drug;toxicokinetics

The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09505001-003）；and by Shanghai R＆D Public Service Platform Project（BDZ2290100）

MA Jing，E-mail：jma＠ncdser.com，Tel：（021）50801763

R965.1

A

1000-3002-（2015）04-0621-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.014

2014-11-05接受日期：2015-04-27）

（本文编辑：乔虹）

国家科技重大专项（2012ZX09505001-003）；上海市研发公共服务平台项目（13DZ2290100）

赵琪，女，硕士研究生，主要从事药物毒理学研究，E-mail:zhqi1990＠126.com，Tel:13817479905;马璟(1963-)，女，博士，研究员，博士生导师，主要从事药物毒理学研究。

马璟，E-mail:jma＠ncdser.com,Tel:(021) 50801763