HPLC法测定肝素钠原料中EDTA－2Na的残留

要 辉 纪万里 白育庭

湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437000

HPLC法测定肝素钠原料中EDTA－2Na的残留

要 辉 纪万里 白育庭

湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437000

目的：建立肝素钠原料中EDTA－2Na的残留测定方法。方法：色谱柱：WondaSil－C18（200mm×4.6mm×5μm）；流动相：pH为3.0的0.025mol／l硫酸铵溶液；检测波长：254nm；检测温度：室温；流速：1.0ml／min；进样量：20μl。结果：EDTA－2Na在0.1～1.5μg／m l浓度范围内具有良好的线性关系，平均回收率为100.09%，RSD为1.0%。结论：本法测定肝素钠中EDTA－2Na具有良好的专属性、线性、重复性和准确度，适用于EDTA－2Na的检测。

肝素钠；EDTA－2Na；残留测定

肝素钠是从猪小肠黏膜中提取精制的含有硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属于不均一的多糖分子，通常分子量在3000～30000道尔顿，临床常作为注射剂使用。肝素钠本身带负电荷，能干扰血凝过程的许多环节，其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ （AT－Ⅲ）结合，而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。具体涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白［1］。肝素钠作为原料药，中国药典中明确规定了其重金属限度的检测，但由于其来源于动物组织提取，实际生产工艺中均要增加去除重金属的工艺。目前多采用添加EDTA－2Na来螯合重金属，形成水溶物后，经分级沉淀步骤去除螯合物。EDTA－2Na收载于FDA《非活性组分指南》，可用于非注射和注射给药制剂，会与人体内的钙离子形成螯合物，引起低血钙等症状［2］。由于肝素钠生产过程中使用EDTA－2Na去除重金属，所以在终产品中可能残留EDTA－2Na，对其进行检测有重要的意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器 TG332A型分析天平（湘仪天平仪器设备有限公司）；LC－15C型高效液相色谱仪（日本岛津）；LC－20AD型紫外检测器（日本岛津）；

1.2 材料 硫酸铜（分析纯，天津市永大化学试剂有限公司）；EDTA－2Na（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；肝素钠（注射级，批号：HM120401、HM120402、HM120403，石家庄市协和药业有限公司）。水为自制纯化水 （二级反渗透法）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料WondaSil-C18（200mm×4.6mm×5μm）；流动相：0.025mol／l硫酸铜溶液［3］（用稀硫酸调节pH至3.0）；检测波长：254nm；流速：1.0ml／min；检测温度：室温；进样量：20μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白溶液的制备 精密量取0.04mol／l硫酸铜溶液1.0ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 对照品未络合溶液的制备 精密称取EDTA－2Na 10mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品未络合溶液的制备 精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 对照品溶液的制备 精密量取1.0m l对照品未络合溶液，置100m l量瓶中，再精密加入0.04 mol／l硫酸铜溶液1.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.5 供试品溶液的制备 精密称取供试品100mg，置100ml量瓶中，再精密加入0.04 mol／l硫酸铜溶液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验 按照2010年版《中国药典》二部附录VD高效液相色谱法［4］，检测波长254nm，分别精密量取空白溶液、供试品溶液、对照品溶液、对照品未络合液、供试品未络合液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。

由图1可知，在此色谱条件下，EDTA－2Na经硫酸铜络合后在254nm处有吸收，硫酸铜与EDTA－2Na峰可完全分离，分离度大于1.5，主峰峰形较好，理论塔板数大于2000，并且单独的硫酸铜、EDTA－2Na、肝素钠均不干扰测定因此，本方法系统适用性、专属性良好。

2.4 流动相溶液pH值考察 采用不同pH进行EDTA－2Na检查，精密量取对照品溶液各20μl，注入液相色谱仪，考察pH值对本品EDTA－2Na的影响。由表1可知，pH值对对照品的峰面积无影响，且不同pH值条件下的理论塔板数均大于2000，具有良好的系统适用性。

2.5 线性考察 分别精密量取对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.25、1.5ml置100m l量瓶中，精密加入0.04mol／l硫酸铜溶液1.0ml，加水稀释至刻度，摇匀，分别制成每1ml溶液中含0.1、0.5、1.0、1.25、1.5μg的对照品溶液，分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。得线性方程为：y＝10593.8043x－329.8098，r＝0.9999。结果表明，EDTA－2Na在0.1～1.5μg／ml范围内具有良好的线性关系。

2.6 精密度实验 平行配制对照品溶液6份，按照上述色谱条件进针测定样品中EDTA－2Na的含量，RSD为0.26%。说明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一批样品，平行制备6份，同法测定，结果RSD为0.42%，重现性较好，符合验证方案的要求。

2.8 稳定性实验 对照品溶液和供试品溶液置室温放置，分别于0、1、2、3、4h测定。结果表明样品溶液在4h内稳定。

2.9 回收率实验 为确定本测定方法的准确度，进行了加样回收率试验。EDTA－2Na贮备液的制备：精密称取10mg EDTA－2Na，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。120%回收率溶液的制备：精密称取供试品50mg，置50ml量瓶中，精密加入EDTA贮备液1.2ml，精密加入0.04 mol／l硫酸铜溶液1.0ml，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。同法分别吸取贮备液1.0ml及0.8ml配制100%回收率溶液和80%回收率溶液。分别精密量取以上溶液各20μl注入液相色谱仪，计算回收率。由表2可知，该方法测定回收率其平均回收率为100.09%，RSD为1.0%，表明本方法用于EDTA－2Na测定具有较好的准确度。

2.10 检测限及定量限 取对照品溶液，加水不断稀释至适宜浓度，以信噪比为3∶1时的浓度确定检测限，测得为0.05μg／ml；以信噪比为10∶1时的浓度确定定量限，测得为0.1μg／ml。

2.11 样品测定 按照上述所确定的色谱方法检测批号为HM120401、HM120402、HM120403中的EDTA－2Na残留量，三批样品分别为0.01%，0.01%，0.00%。

3 讨论

EDTA－2Na的检测方法较多，常用的有滴定法和比色法，但这些方法的选择性不高，专属性不好。本研究选用专属性较好的HPLC法来测定，回收率较好，准确度高，符合验证方法的要求。另外，铜离子可与EDTA－2Na形成较为稳定的螯合物［5］，保证了室温放置4h其性质不变。综上所述，HPLC法检测EDTA－2Na的残留具有很好的灵敏度，准确度，简单方便。

［1］于广利，赵峡.糖药物学［M］.青岛：中国海洋大学出版社，2012：315－320.

［2］郑俊民.药用辅料手册［M］.北京：化学工业出版社，2005：263.

［3］Lon HALL，L loyd Takahash.determination of disodium edetate in ophthalmic and contact lens care solutions by reversed phase hight performance liquid chromatography［J］.JPharm S ci，1988，77（3）：247.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典二部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录VD.

［5］罗祎，赵永彪，李淑娟，等.反相高效液相色谱法测定食品中EDTA的含量［J］.中国食品添加剂，2006，17（4）：156.

Determination of residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium by HPLC

YAO Hui*JIWan Li BAIYu ting
HuBei University Of Science And Technology School of Pharmacy，HuBei province，Xian ning437000，China

ObjectiveTo establish themethod for determination of the residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium.MethodThe chromatographic column isWondaSil－C18（200mm×4.6mm×5μm）；mobile phase0.025mol／l ammonium sulfate（pH 3.0）；the column temperature is room temperature；detection wavelength is254nm；the flow rate is1.0ml·min－1；the amountof injection is 20ul.ResultsThe chromatographicmethod to detect the use of heparin raw material in EDTA－2Na is accurate，and the calibration curve of disodium edetate is linear in the range of0.1～1.5μg／ml.the average recoverywas100.09%，RSD was1.0%.ConclusionThemethod is accurate，reproducible which can be used for the residues of EDTA－2Na in raw heparin sodium.

heparin sodium；EDTA－2Na；residues

R943

A

1007－8517（2015）16－0028－02

2015.05.15）

要辉（1983－），药学硕士研究生，主要从事新药研发及分析。E－mail：yaohui003＠hotmail.com