肠道病毒2A蛋白酶与细胞蛋白相互作用的研究进展

赵天生，方 舒，黄孝天，夏燕华

·综 述·

肠道病毒2A蛋白酶与细胞蛋白相互作用的研究进展

赵天生1，方 舒2，黄孝天1，夏燕华1

肠道病毒感染可导致多种重要的人类疾病，给人类健康和生命带来极大的威胁。肠道病毒进入宿主细胞后会影响细胞的蛋白质合成、大分子转运、抗病毒反应等过程，据研究这与肠道病毒2A蛋白酶作用于细胞蛋白有关。在此，我们对肠道病毒2A蛋白酶与宿主细胞蛋白间的相互作用进行综述，以便全面而深入的了解2A蛋白酶在肠道病毒致病过程中的重要作用，有助于更好的理解肠道病毒的致病机理，为防治肠道病毒感染提供新的思路。

肠道病毒；2A蛋白酶；蛋白相互作用

肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒(poliovirus, PV)、柯萨奇病毒(coxsackievirus, CV)、埃可病毒(ECHO virus)和新肠道病毒(enterovirus, EV)等。这些病毒感染可导致多种重要的人类疾病，如脊髓灰质炎、手足口病、病毒性脑膜炎、病毒性心肌病等。许多动物病毒编码蛋白酶，这些蛋白酶通常具有两方面的功能，一方面裂解病毒多肽前体产生成熟蛋白，构成病毒体或参与病毒复制；另一方面作用于细胞蛋白，细胞蛋白通常作为蛋白酶的作用底物，经蛋白酶裂解后影响细胞的生命过程。肠道病毒编码一种2A蛋白酶(2Apro)，该酶不仅参与病毒的生命周期，而且作用于多种细胞蛋白，影响宿主细胞的多种重要的生物学功能。

1 肠道病毒及其基因组结构

肠道病毒具有相似的基因组结构和组成。基因组为约7.4 kb的单股正链RNA，仅含一个开放阅读框(open reading frame, ORF)，编码约2 000个氨基酸组成的多聚蛋白。在基因组的5′ 端和3′ 端为保守的非编码区(untranslated region, UTR)。3′UTR末端有一个长度可变的多聚腺苷酸尾poly(A)，而5′ UTR共价结合一个小分子量蛋白质VPg。多聚蛋白被病毒和细胞的蛋白酶水解成4个结构蛋白VP1～VP4和7 个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。

2 2Apro在肠道病毒生命周期中的重要功能

2Apro属于半胱氨酸蛋白酶家族[1]，约由150个氨基酸组成。突变分析表明，His20，Asp38和Cys109构成了PV 2Apro的催化中心[2]。2AproC-端含有一个酸性结构域，据研究EV71和 CVB3 2Apro在酵母细胞中表现出强烈的转录活性，而该酸性结构域则是转录活性所必需的[3]。

2Apro的首要功能是参与病毒的多肽切割和蛋白成熟。肠道病毒的11个成熟蛋白是在2Apro和3Cpro的作用下分三步完成的：首先通过2Apro的自我切割使P1前体蛋白从肠道病毒多聚蛋白中释放出来，进而在3Cpro的作用下使多聚蛋白P2(2ABC) 和P3(3ABCD)分离，最后在2Apro和3Cpro的共同作用下形成单个成熟的病毒蛋白。除此之外，2Apro可稳定病毒RNA、促进负链RNA的合成和病毒蛋白的翻译[4]。

3 肠道病毒2Apro对宿主细胞的重要作用

3.1 2Apro对细胞的毒性作用 研究发现，2Apro对多种细胞具有毒性作用。PV 2Apro在HeLa细胞中的瞬时表达可诱导CPE(如细胞变圆，脱落等)，PV 2Apro缺失突变株对HeLa细胞毒性明显减弱[5]。CVB3 2Apro的长期稳定表达则可激活caspases，诱导细胞凋亡[6]。PV 2Apro的表达对酵母细胞具有强烈的毒性作用，表达5h后酵母细胞生长受抑，细胞存活率急剧下降[7]。利用RNA干扰作用使2A表达沉默可明显增强感染细胞的活力。该现象在动物实验中尤为突出，CVB3 2A的沉默表达使小鼠组织中病毒的滴度显著下降，组织损伤减轻并极大延长了小鼠的存活时间[8]。

3.2 2Apro对细胞毒性作用的分子机制 肠道病毒 2Apro对宿主细胞的毒性作用与其作用于多种细胞蛋白有关。归纳起来，与2Apro相互作用的细胞蛋白有翻译起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)4G、多聚腺嘌呤结合蛋白(poly(A)-binding protein, PABP)、核孔蛋白、细胞骨架蛋白等。2Apro与细胞蛋白的相互作用导致细胞的多种功能，如转录、翻译、大分子转运和抗病毒反应等受到影响。

3.2.1 2Apro切割eIF4G和PABP影响宿主细胞的蛋白质合成 对于多数真核mRNAs，翻译起始是从异源三聚体复合物eIF4F识别帽结构(7mGpppN)和PABP开始的。eIF4F由帽结合蛋白(cap-binding protein) eIF4E、DEAD-box 解旋酶eIF4A和翻译起始因子eIF4G所构成。其中，eIF4G是起始蛋白质翻译最重要的调节分子。肠道病毒感染可致宿主细胞蛋白合成快速终止和病毒mRNA翻译的有效起始[9]。研究发现，在PV和CV感染细胞中，eIF4G的切割同步于细胞蛋白合成的终止，这种终止与eIF4F复合物中eIF4G的水解有关[10]。进一步研究发现，eIF4G的水解是由2Apro所介导的[11-12]。早期研究者并未从PV感染细胞抽提物中共纯化2Apro和eIF4G，猜测可能还要其他的翻译因子被活化并参与2Apro对eIF4G的蛋白裂解。直到近年来，体内体外实验均证明，PV、CV、EV 2Apro可直接切割eIF4G[13]。2A突变病毒株感染COS-1细胞后，eIF4G未发生水解[14]，至此证明肠道病毒可通过2Apro切割eIF4G影响宿主细胞的蛋白质合成。

大多数真核mRNAs包含一个39nt的poly(A)尾。关于poly(A)尾，目前已知的功能是参与mRNA的核-质转运，稳定细胞质mRNA，以及增强mRNA翻译。poly(A)尾在翻译中的作用被认为是由PABP所介导的。PABP是真核RNA结合蛋白家族中的代表，在连接40S核糖体亚单位和mRNA以及招募60S核糖体亚单位中起着重要作用。研究发现，只有通过poly(A)尾与PABP相连的mRNAs才能被翻译[15]。向兔网织红细胞裂解物(rabbit reticulocyte lysate，RRL)翻译系统中加入poly(A)，具有帽和poly(A)尾结构的mRNAs的翻译受到抑制。这种抑制效应可因加入过量PABP得到缓解，表明加入的poly(A)隔绝了内源性PABP[16]。深入研究发现，CV感染细胞中，PABP同样被2Apro切割，使宿主细胞蛋白翻译受阻，这可能是肠道病毒感染影响宿主细胞翻译的另一种机制[17]。

3.2.2 2Apro作用于核孔蛋白影响大分子的核-质转运 由30多种核孔素(nucleoporins, Nups)构成的核孔复合物(nuclear pore complex, NPC)是细胞内大分子物质(包括RNAs和蛋白质)运输的主要通道，也是病毒作用的主要目标。研究发现，PV感染可改变大分子的细胞定位，如使核蛋白定位于细胞质[18]。电镜观察发现，PV 2Apro可诱导NPC严重的结构性损伤，其构成成分Nup98、Nup153和Nup62先后不同程度的被2Apro降解，在蛋白质核运输受阻的同时RNA的定位也发生紊乱[19-20]。影响核-质转运对于肠道病毒的意义可能有两点：细胞质中核蛋白的增加可促进病毒的复制，同时阻止转录因子入核可防止一系列抗病毒反应基因的转录。

3.2.3 2Apro影响宿主细胞的抗病毒反应 尽管细胞的翻译过程、大分子运输受阻必然影响抗病毒基因的表达，但研究发现2Apro可直接作用于细胞免疫系统，影响细胞的抗病毒反应。PV1-3型和EV71均能在IFN-а预处理的细胞中复制，而2Apro的突变可使PV对IFN-а敏感[21]。RIG-I和RIG-I样受体MDA5是天然抗病毒反应中的关键分子，一旦识别到病毒RNA就会与线粒体抗病毒信号 (mitochondrial anti-viral signaling, MAVS)相互作用，最终诱导Ⅰ型干扰素产生。研究发现，肠道病毒感染时，MDA5以不同方式降解，如PV感染时MDA5的降解是由caspase和蛋白酶体所介导的，而CVB3感染时MDA5和 MAVS的切割都是由2Apro介导的[22-23]，说明肠道病毒可直接作用于干扰素系统来拮抗细胞的抗病毒反应。

3.2.4 2Apro作用于细胞骨架蛋白dystrophin导致心肌病 人类扩张型心肌病有两种，一种是家族遗传型，主要原因是细胞骨架蛋白dystrophin基因发生突变；另一种是获得型，是由多因素造成的，其中约30%是由肠道病毒感染导致。研究发现，无论哪一种心肌病实际上都是细胞骨架性疾病，如细胞骨架蛋白dystrophin的移码突变或错义突变都可导致心肌病的发生[24]。肠道病毒感染可致细胞骨架蛋白dystrophin降解，其作用主要是由2Apro所介导的[25]。体内外实验表明，CVB3 2Apro的确能切割人类和大鼠dystrophin，导致心肌细胞形态和功能的破坏，被认为是形成扩张型心肌病的主要原因[26]。CVB感染的小鼠模型中，过量表达2A蛋白可导致严重的心肌功能障碍和扩张型心肌病[27]。

4 讨 论

细胞蛋白网络是一个复杂而又高度有序的整体，蛋白质相互之间是相互关联的，既有促进也有制约作用，它们共同维护细胞的生命进程。细胞被病毒感染后，某一种或几种细胞蛋白受到病毒蛋白酶的水解作用，不仅影响该蛋白的结构和功能，同时会打破细胞蛋白网路的有序性，进而影响整个细胞的生命进程。为了给病毒生命周期创造一个积极的细胞内环境，单个病毒蛋白能够调节基因表达的多个步骤，如肠道病毒2Apro作用的细胞蛋白涉及到转录、翻译和核-质转运等。

病毒作为一种严格的细胞内寄生微生物，其目的显然不是为了杀死宿主细胞而使自身失去寄居的场所，其终极目标是复制自我产生子代，而复制除了需要各种资源和能量外，还会受到来自细胞免疫系统的抗病毒作用。由于肠道病毒的翻译起始过程不同于真核细胞，因此2Apro裂解eIF4G仅会关闭细胞蛋白合成而不会影响病毒的蛋白合成，因此可直接接管宿主细胞的蛋白合成机器，解决了复制所需要资源和能量的问题。蛋白酶对宿主蛋白水解的同时会影响其他的细胞功能，如抗病毒反应。抗病毒反应中各种蛋白质的合成由于eIF4G的水解而受到影响。天然免疫途径的活化和抗病毒反应的建立依赖于信号从核孔复合体转运到核膜。PV 2Apro水解核孔素破坏核孔复合体结构，从而阻止大分子物质的核-质转运。转运受阻可抑制抗病毒信号的核输出或阻止对病毒有害的细胞mRNA的输出。因此，肠道病毒利用自身编码的蛋白酶从不同水平阻止细胞基因表达，如翻译，转录或蛋白和RNA在细胞核与细胞质间的转运。除此之外，肠道病毒还可直接作用于干扰素产生过程中涉及到的重要分子如MDA5和 MAVS，直接影响细胞的抗病毒反应。由此可见，病毒蛋白酶在病毒的生命周期中起着极为重要的作用。

对病毒蛋白酶的研究有助于从分子水平理解病毒复制和转录的机制。更为重要的是，病毒蛋白酶可作为揭示其靶蛋白确切功能的一种工具。从这点来说，肠道病毒2Apro不仅在处理肠道病毒多聚蛋白而且在与宿主细胞的相互作用中都起到了关键性作用。通过揭示肠道病毒2Apro靶蛋白，我们能够制定与2Apro相互作用的细胞网络，从而有助于我们从分子水平深入理解病毒蛋白酶的功能及揭示肠道病毒的分子致病机制。

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Xia Yan-hua, Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

Research progress on interaction between enterovirus 2A protease and cellular proteins

ZHAO Tian-sheng1,FANG Shu2,HUANG Xiao-tian1,XIA Yan-hua1

(1.MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330006,China; 2.UndergraduateofClinicalMedicine,Grade2011,MedicalCollege,NanchangUniversity,Nanchang330031,China)

Enterovirus infection can lead to a variety of important human diseases and bring great threat to human health and life. When enterovirus infects host cells, some cellular processes including protein synthesis, macromolecular transport and antiviral response will change, which is attributed to the role of viral 2A protease on cellular proteins. Here we summarized the interactions between viral 2A protease and cellular proteins, which is helpful to better understand the important function of 2A protease and the pathogenic mechanism of enterovirus and provide a new way for prevention and treatment of enterovirus infection.

enterovirus; 2A protease; protein interaction

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.014

江西省自然科学基金(20142BAB205070)和国家自然科学基金(81160196)联合资助

夏燕华，Email: xiayanhua@ncu.edu.cn

1.南昌大学医学院，南昌 330006; 2.南昌大学医学院2011级临床医学系，南昌 330031

Funded by the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No. 20142BAB205070) and the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196)

R373.2

A

1002-2694(2015)09-0850-04

2014-12-11；

2015-04-22