Angiopep-2修饰的纳米递药系统和纳米成像系统在胶质瘤诊疗中的应用

金莹莹 张家文

引 言

脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的原发肿瘤，目前传统的脑胶质瘤的治疗手段是手术切除结合术后放化疗等联合治疗，胶质瘤的术前影像诊断和术中影像精确定位对病人的预后以及术后生存率尤为重要，但目前的显影剂半衰期短、靶向性差且不能穿越血脑屏障，尤其对早期胶质瘤术前影像诊断和术中影像指导效果较差。因此研究出一种半衰期长、可以高效穿越血脑屏障并靶向到肿瘤的影像学对比剂显得十分迫切。关于胶质瘤的治疗，同样由于存在血脑屏障，化疗药物难以进入脑组织继而到达肿瘤区域。

血脑屏障(blood brain barrier，BBB)为存在于血液和脑组织间的一种特殊屏障，由毛细血管内皮、基膜和星形胶质细胞的血管周足等构成，可阻止某些物质经血液转运至中枢神经系统，从而保障脑细胞微环境稳定。这种结构虽可有效保护脑组织不受血液循环中有害物质的侵害，但也是限制作用于中枢神经系统(CNS)的药物发挥其疗效的障碍[1]。

BBB的渗透性取决于脑毛细血管内皮细胞(BCECs)之间的紧密连接，研究表明，组成BBB的BCECs上有许多受体，包括转铁蛋白受体、胰岛素受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)受体等，其中LRP1在胶质瘤细胞上也呈高表达。研究发现，一种由19个氨基酸分子组成的新型多肽Angiopep-2(24KDa)，是LRP1受体的配体，穿胞能力和累积能力均高于转铁蛋白、乳铁蛋白、抗生物素蛋白等，对BBB的穿透能力是转铁蛋白单抗的50倍[1]，在脑实质的分布容积是转铁蛋白(Transferrin)的2.5倍。研究表明，人脑胶质瘤细胞高表达LRP受体，且经Angiopep-2修饰的纳米颗粒具有极好的BBB穿透能力，能显著增加脑部蓄积。提示LRP可能成为脑胶质瘤靶向递药的一个潜在作用靶点。

本文综述了Angiopep-2的材料特点，血脑屏障的特征，以及Angiopep-2修饰的纳米递药系统及显像系统的研究进展。

Angiopep-2理化特性及脑靶向性

1.Angiopep-2理化特性

Angiopep属于Kunitz型结构域家族，Kunitz型结构域系指含有6个保守的半胱氨酸，通过形成3对二硫键维持一定空间构型的结构域，能直接与多种蛋白水解酶结合，并抑制后者的活性。Demeule等将Kunitz型结构域的氨基酸序列进行改造，得到包括Angiopep-2在内的一类衍生肽，并将其命名为Angiopeps。

2.Angiopep-2双靶向特性

Angiopep-2具有高效穿胞能力，是LRP1的配体，可以通过LRP1介导穿越细胞膜，研究表明，经Angiopep-2修饰的纳米颗粒具有比普通纳米颗粒更强的穿越血脑屏障的能力[2]，由于胶质瘤细胞表面也高表达LRP，Angiopep-2修饰的纳米颗粒穿越血脑屏障后可以靶向于胶质瘤细胞，从而发挥药效。因此，Angiopep-2具有血脑屏障和胶质瘤双极靶向能力，可以作为靶向载体用于胶质瘤的诊断和治疗。

3.Angiopep-2的转运机制

Angiopep-2是LRP的配体，Angiopep-2修饰后的纳米颗粒受到各种LRP配体的竞争抑制，包括受体相关蛋白(RAP)、乳铁蛋白等，其中，RAP能够对所有LRP的配体产生竞争抑制，乳铁蛋白也被证实能通过LRP途径进行细胞转运；且研究表明，脑组织对Angiopep-2的摄取，在一定范围内，摄取量随着浓度的增加而增加，即具有浓度依赖性。以上结果说明，LRP介导的内吞途径可能是Angiopep-2修饰的纳米粒进入细胞的主要机制。

物质通过内吞途径进入细胞机理包括受体介导内吞、吸附介导内吞和巨吞饮途径。各种内吞机理具有不同进程，其中受体介导内吞通常与网格蛋白（clathrin）相关，而吸附介导内吞通常与小窝蛋白（caveolae）相关。不同的内吞进程受到不同的物质抑制，加入各种抑制剂后，Angiopep-2修饰的纳米粒在BCECs的摄取均明显减少，说明受体介导内吞、吸附介导内吞以及巨吞饮途径均在纳米颗粒的细胞摄取中起作用。

血脑屏障特征

血脑屏障是一种特殊的脑生理构造，它严格控制脑组织和血液之间分子、离子和细胞的交换，保障脑部微环境的稳态[3]。血脑屏障由内皮细胞(ECs)、周细胞(PCs)、基膜和星形胶质细胞组成，ECs通过紧密连接(TJs)组成血管壁，其表面围绕一层不完整的PCs，ECs和PCs外覆有基膜，星形细胞的终足形成鞘将血管壁包裹在内。血脑屏障通过两种方法控制血液中分子入脑：

第一，ECs之间的紧密连接使得血液中分子通透性极低。首先，血脑屏障的细胞间缝隙大小大约为0.4nm[3]，远小于非神经内皮细胞间隙(6～7nm)；另外，紧密连接产生一个极高的电阻(1000～2000Ωcm)，比外周毛细血管(2～20Ωcm)高出很多，有效阻止了很多带电物质和离子入脑。

第二，血脑屏障的ECs缺少开窗能力，鲜少有吞饮小泡，但却高表达一些外转运物质，如P-糖蛋白，限制很多分子通过跨细胞转运方式进入大脑。血脑屏障高效地阻止很多药物在脑内的递送分布，分析显示大约只有1%的药物可以穿越血脑屏障并作用于中枢神经系统。

当脑内原发肿瘤或转移瘤超过1～2mm的时候，血脑屏障的结构和功能都受到累及破坏：内皮连续性中断，紧密连接受累[3]，基膜破坏，内皮-星形细胞的交互作用受到干扰。

现在临床上是用小分子探针通过BBB的损伤部位对胶质瘤显像，但在肿瘤切除术中，由于肾的高清除率，不得不采用多次注射的方式来显示肿瘤位置及边缘。因此，研制在血中长循环时间、主动跨越BBB、高图像敏感性和高靶向特异性的探针对胶质瘤的诊断和治疗都十分重要。

对于胶质瘤的靶向治疗，根据胶质瘤级别不同选用不同的递药系统。在脑胶质瘤晚期，BBB受到破坏，此时脑胶质瘤与其他肿瘤类似，具有增强渗透滞留(EPR)效应，在此基础上采用胶质瘤靶向头基修饰能提高药物在胶质瘤细胞内的浓集；但在脑胶质瘤早期，BBB保持相对完整，需选用对BBB、胶质瘤细胞均高亲和性多肽作为靶向头基才可能实现跨越BBB、靶向胶质瘤[4]。

Angiopep-2修饰的不同的纳米显像系统及纳米递药系统

1.ANG/PEG-UCNPs纳米显像系统

ANG/PEG-UCNP是一种Angiopep-2共价连接、PEG修饰的上转化纳米材料，可以通过LRP介导穿越血脑屏障进而靶向到胶质瘤，与其他材料相比，ANG/PEG-UCNPs具有MR成像和近红外上转化荧光成像的多模态成像特点，在早期胶质瘤术前诊断和术中定位中可以提供较准确边界、较高的对比度，而且，ANG/PEG-UCNPs在体内没有明显毒副作用，生物相容性较好，是一种极具发展前景的双靶向显像纳米材料。

Angiopep-2共价修饰的纳米材料更易被细胞摄取。将U87MG 和BCECs 细胞与ANG/PEGUCNPs共培养后，用980nm光激发，通过共聚焦显微镜观察，可看到细胞核周围有最强上转化荧光信号[5]，这表明ANG/PEG-UCNPs已被摄取进入胞质内。而细胞对ANG/PEG-UCNPs的摄取明显比PEGUCNPs多，这与ANG靶向LPR受体有关，加入高浓度ANG抑制剂后，细胞对ANG/PEG-UCNPs的摄取明显减少。以上研究结果表明，U87MG和BCECs细胞通过LRP受体介导使得 ANG/PEGUCNPs的摄取量明显提高。

在MRI中，ANG/PEG-UCNPs比Gd-DTPA等材料具有更高的成像性能。对载瘤小鼠行MR成像分析，结果显示，在MR的T1加权成像中，与PEG-UCNPs和Gd-DTPA相比，注射ANG/PEG-UCNPs组的信号明显增强，肿瘤边缘也更清晰。信号强度定量分析表明，注射ANG/PEGUCNPs后肿瘤区域平均信号强度迅速增加，在1小时内达到最高值并维持较长时间（＞2h）；注射PEG-UCNPs组信号强度上升缓慢，最大信号强度较弱；而注射 Gd-DTPA组由于肾清除率较高，信号强度非常弱。

在近红外荧光成像中，ANG/PEG-UCNPs也具有极大优势。荧光定位是胶质瘤切除术中的常用定位方法，目前常用的荧光注射剂是5-ALA，该荧光剂被胶质瘤摄取后可转化为荧光原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，后者在蓝光激发下可发出红光然后以此定位，但PpⅨ耐光性差、有严重的光漂白性，且组织穿透性较差，而ANG/PEG-UCNPs不具有以上缺点。给载瘤小鼠静脉注射ANG/PEG-UCNPs、PEG-UCNPs和5-ALA后处死，在体外进行上转化荧光现象，观察脑部荧光信号，ANG/PEG-UCNPs 组肿瘤区信号增强而周围正常脑组织信号较弱，可以清晰的观察到肿瘤情况，PEG-UCNPs组无信号，5-ALA组则是全脑信号。HE染色检查、荧光显微和光谱仪检测也表明，细胞对ANG/PEG-UCNPs的摄取明显多于PEG-UCNPs。

对于该纳米材料的毒性，在体外，用中位生存时间来评价，在体内，可以用体重变化、苏木素或HE染色分析、血生化和血液学检测来监测。各项检查均显示，ANG/PEG-UCNPs无明显已知毒性，生物相容性较好，可以作为对比剂用于医学影像靶向成像[6]。

2.Den-RGD-Angio纳米探针

Den-RGD-Angio是一个新型的双极靶向的多模态纳米探针，可以用于MR和光学成像，同时在肿瘤的术前诊断、定位及术中指导切除中有重要作用[7]。

Den-RGD-Angio纳米探针是将c[RGDyK]肽和Angiopep-2共同标记在大分子物质PAMAM-G5上，其中c[RGDyK]可特异性地与肿瘤血管上的整合蛋白结合，Angiopep-2则与高表达于BBB和胶质瘤上的LRP1受体结合，c[RGDyK]肽与Angiopep-2在细胞摄取Den-RGD-Angio中有协调作用。

由于材料的双极靶向特性和协同作用的存在，Den-RGD-Angio的细胞摄取量非常高，可以更多的靶向聚集在肿瘤处，提高成像效果，同时，该探针的直径在11～16nm，可以维持较长的循环寿命。

Den-RGD-Angio纳米探针具有MR和近红外荧光的多模态成像特点，近红外荧光显像的高敏感性可以弥补MR成像的不足，得到高空间分辨率和高敏感度的图像。同时因为纳米探针上标记了很多MR螯合剂，总体弛豫时间延长，因此，即使脑组织中纳米探针浓度很低也可以产生可探测的MR信号[7]。近红外荧光的组织穿透力高，可以更敏感、更便捷的动态追踪到纳米探针的脑内分布。MR和光学成像显示，Den-RGD-Angio不仅能提供很高的T/N比率(肿瘤/正常脑组织比率)还能精确描绘出肿瘤边缘。EPR效应、血脑屏障通透性增加以及双极靶向都是Den-RGD-Angio高T/N比率的原因。通过与体外组织学成像比对，发现Den-RGD-Angio纳米探针准确度较高，并且实验证明，该探针的细胞毒性低，因此，Den-RGD-Angio是可以用于术中肿瘤定位及手术指导的高性能纳米靶向探针[7]。

3.PAMAM-PEG-Agiopep/DNA纳米基因递释系统

PAMAM-PEG-Agiopep/DNA系统是以PAMAM为基础载体，携带介导肿瘤细胞凋亡的基因，采用胶质瘤和BBB双靶向Angiopep为靶向头基，构建出的基因药物递释系统。

PAMAM-PEG-Agiopep基因递释系统连接的基因，是最近发现的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)，它是一种介导细胞凋亡的信号分子，具有TNF家族成员的许多特性，能够特异性与胶质瘤细胞表面受体结合诱导凋亡，但不杀伤正常细胞[8]。

研究表明[9]，Angiopep修饰后能够增加载体在BCECs上的摄取，并且在一定范围内呈现出浓度依赖性，进一步研究发现，游离的Angiopep-2能对PAMAM-PEG-Angiopep的摄取产生竞争抑制，同时，低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP的各种配体，包括受体相关蛋白RAP以及乳铁蛋白Lf，均能抑制PAMAM-PEG-Angiopep的细胞摄取，说明PAMAM-PEG-Angiopep通过LRP介导的内吞途径摄取进入BCECs。PAMAM为高分子物质，可通过细胞膜穴样内陷依赖性内吞和巨胞饮途径进入细胞[10]，而经Angiopep修饰的载基因纳米粒可通过多种途径内吞进入细胞，说明纳米粒保留了PAMAM的高分子特性。

对于载基因纳米粒的体内分布，用荧光素标记DNA后进行活体成像，以及 标记载体后进行放射性检测，两个实验结果共同显示，Angiopep修饰后能够提高载基因纳米粒的小鼠脑内分布，并且纳米粒在脑内分布与Angiopep的修饰程度相关；Angiopep修饰后能有效提高纳米粒在脑内广泛区域的表达效率，为脑内疾病治疗提供良好的基础。

4.ANG-PEG-NP纳米递药系统

ANG-PEG-NP纳米递药系统是一种Angiopep修饰的、PEG-PCL共价连接的纳米递药系统，可以明显提高纳米颗粒穿越血脑屏障进而靶向胶质瘤的能力，提高肿瘤部位药物浓度。

经Angiopep修饰后，U87MG细胞对纳米颗粒的摄取量增加，并且具有时间依赖性和能量依赖性。加入游离的LRP受体的配体后，ANG-NP的摄取量大大下降，说明ANG-NP是通过高表达于血脑屏障和胶质瘤的LRP受体介导高效穿越血脑屏障进入胶质瘤细胞。

ANG-NP-PTX纳米颗粒被Angiopep修饰后体积稍增大，但仍小于100nm，这给提高纳米颗粒的药代动力学提供了可选择的发展空间，也有利于纳米颗粒穿越BCECs。关于Angiopep修饰的纳米材料进入BCECs的机制，ANG-PEG-NP与PAMAMPEG-Agiopep不同，后者通过网格蛋白和小窝蛋白介导，还有一部分通过巨吞饮途径，而ANG-PEGNP则主要是小窝蛋白介导的内吞，很少部分通过网格蛋白介导和巨吞饮途径进入。这是由于纳米材料的入胞途径是由电荷、材料组成、化学性质以及细胞种类决定[11]。

ANG-PEG-NP纳米递药系统可以连接不同的药物，比如紫杉醇(PTX)、阿霉素(DOX)，以结合PTX的给药系统ANG-PEG-NP-PTX为例研究该递药系统疗效。

从细胞毒性曲线和凋亡细胞的流式细胞仪测试来看，NP-PTX比紫杉醇更有效，而经Angiopep修饰后的载PTX纳米颗粒治疗效果更好[12]，与NPPTX相比，ANG-PEG-NP的半抑制浓度(IC)值减少，早、晚期U87MG细胞凋亡比例增加，说明经配体修饰的纳米颗粒被胶质瘤细胞摄取的量增加，疗效更佳。且由于结合了PEG，纳米递药颗粒被内质网摄取的比率大大降低，从而靶向积聚于肿瘤的药物浓度也增加。

5.O-MWNTs-PEG-ANG纳米递药系统

近年来，一种经Angiopep-2修饰的聚乙二醇化氧化多壁纳米碳管(O-MWNTs)即O-MWNTs-PEG-ANG正在用于胶质瘤的治疗研究，O-MWNTs-PEG-ANG也是一种双靶向递药系统，且疗效好，组织相容性高，毒性低，是一个具有发展前景的双靶向纳米递药系统。

由于Angiopep-2可以通过LRP的介导双极靶向于血脑屏障和胶质瘤[4，12]，而LRP在血脑屏障和胶质瘤上都高表达，因此经过Angiopep-2修饰的O-MWNTs-PEG-ANG更易被摄取。O-MWNTs-PEG作为一种递药装置属于被动双极靶向，而Angiopep-2作为配体则属于主动双极靶向。

DOX-O-MWNTs-PEG-ANG系统中，O-MWNTs具有芳香结构和极大的表面积，载药率极高，能高达80%[13]，PEG修饰以后可以避免内质网系统摄取，提高半衰期，同时，DOX从DOX-OMWNTsPEG-ANG上的释放具有pH敏感性，在一定范围内pH越低DOX释放越多，因此DOX-OMWNTs-PEG-ANG系统可大大提高药物在肿瘤内的聚集浓度及释放量。

疗效方面，通常用细胞毒性和中位生存期来评估。研究表明，在体外实验中，与DOX-O-MWNTs-PEG及单纯DOX相比，有Angiopep修饰的DOXO-MWNTs-PEG-ANG系统对肿瘤细胞的细胞毒性明显增加，DOX-O-MWNTs-PEG-ANG治疗的载瘤小鼠的中位生存时间也明显延长，说明DOX-OMWNTs-PEG-ANG的疗效更佳。这与DOX-OMWNTs-PEG-ANG的双极靶向有关，DOX-OMWNTs-PEG通过高表达的LRP介导穿越血脑屏障靶向到胶质瘤[14]，可以携带并释放更多的DOX至肿瘤部位，所以疗效更好。

O-MWNTs作为药物携带者不仅疗效显著，而且组织相容性好，毒性低[15]。此外，纳米碳管还可以作为很多成像方法的对比剂，比如MR、近红外荧光、光谱学成像、光声成像、放射性核素成像等，可以将很多疾病的诊断和治疗合为一体。

总结与展望

血脑屏障是脑胶质瘤术前影像诊断和术中指导切除面临的难题，跨越血脑屏障是影响脑胶质瘤预后的决定性因素之一。目前以Angiopep-2为LRP特异性配体，构建既可以靶向血脑屏障又可以靶向胶质瘤的双级靶向递药系统或成像系统，将药物或荧光颗粒高效的靶向到肿瘤，进而发挥药效或显像定位，不仅可以改善以往抗脑胶质瘤药物“入血不入脑，入脑不入瘤”的情形，还可以提高胶质瘤的术前诊断准确性和术中切除精确性。

本文综述的递药系统和成像系统具有各自的优势，但仍然存在很多不足和发展空间，目前Angiopep-2修饰的纳米递药系统和纳米成像系统在胶质瘤的研究多为单独递药或成像系统，而且连接的药物和显像剂较为单一。连接更多元化、更有效的药物以及实现诊疗一体化，即准确影像诊断的同时实施高效靶向治疗将是胶质瘤未来发展方向。

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