应用2215细胞研究中药抗乙肝病毒的进展

傅超,李晨

(1.青岛市食品药品检验检测中心，山东 青岛 266071；2.青岛阜外心血管病医院，山东 青岛 266034)



应用2215细胞研究中药抗乙肝病毒的进展

傅超1,李晨2

(1.青岛市食品药品检验检测中心，山东 青岛 266071；2.青岛阜外心血管病医院，山东 青岛 266034)

目的 应用2215细胞作为药物体外筛选模型目前已发展到比较成熟的阶段，按照现有实验对不同药物处理方法分类，本文归纳总结中草药、中药提取物、中成药以及含药血清等应用2215细胞进行抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的实验研究现状，为中药抗乙肝病毒的研究和开发提供了参考。

2215细胞；中药；抗乙肝病毒；研究进展

乙型肝炎是一种严重影响我国以及世界人类健康和生活质量的疾病。目前，西药治疗乙肝存在大量问题，诸如缺乏特效药，不良反应多，药物依赖性强和价格昂贵等。HBV感染与肝硬化、肝癌的发生有着密切因果关系[1]，从现有疗效确切的我国传统中药中寻找抗乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)的活性物质具有重要的学术和应用价值。

体外细胞培养是筛选抗HBV药物的有用工具。2215细胞模型是Sells 等[2]在1987年将克隆的2个头尾相连的HBV DNA全基因及抗G418质粒直接导入受体细胞——人肝癌细胞株 (liver hepatocellular cells，HepG2)细胞构建而成。目前，该细胞模型已被国内外学者公认且广泛用于抗HBV 药物筛选和评价等研究，现已成为申报抗HBV 新药必须进行的体外实验模型[3]。

现就中草药的不同处理方法对2215细胞分泌乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)影响的实验进展作以下综述。

1 中草药及提取物

在对中草药的筛选中，叶下珠显示出较好的抗HBV作用。国内外均有不同品种叶下珠抗病毒作用比较的报道[4-5]。台湾细叶油柑(PhyllanthussimplexRetz.)为叶下珠属植物，黄正昌等[6]应用2215细胞株及雏鸭乙型肝炎模型，对台湾细叶油柑水提取物和醇提取物进行了体内外抗乙肝活性实验。实验结果显示，台湾细叶油柑水提取物和醇提取物对HBsAg分泌均有一定抑制作用，但其醇提物对HBeAg的分泌无抑制作用。在体内抗鸭乙肝病毒实验中，台湾细叶油柑水提物10 g/(kg·d)和5 g/(kg·d)剂量组于给药5 d、给药10 d和停药3 d时有显著体内抑制鸭乙型肝炎病毒核酸(duck hepatitis B virus DNA，DHBV-DNA)作用，而其醇提物则无抑制DHBV-DNA作用。提示台湾细叶油柑水提取物有抗乙肝病毒作用。

大蒜多糖(garlic polysaccharide，GP)是从大蒜球根中提取的活性成分，具有抗氧化、抑制肝癌细胞生长等作用[7]，郑敏等[8]在2215细胞接种24h后加入大蒜多糖A、B、C，以ELISA法检测HBeAg与HBsAg，并用MTT染色法观察药物的细胞毒性。结果发现大蒜多糖A、B、C对2215细胞半数毒性浓度分别为110.53、108.65及16.00 mg/mL；可剂量依赖性抑制HBsAg的分泌，其半数抑制浓度(half inhibition concentration，IC50)分别为9.31、21.30和1.31 mg/mL，治疗指数分别为11.87、5.10和12.21，对HBeAg的分泌则均无明显抑制作用，即得出大蒜多糖A、B、C在培养2215细胞中可抑制HBsAg的分泌的结论。

芒果苷系芒果叶的主要有效成分。据报道芒果苷具有保肝利胆、平喘镇咳、抗病毒等作用。运晨霞等[9]以Western blot检测芒果苷对2215细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号转导通路中、 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terrninal Kinase,JNK/ c-Jun)、p38蛋白含量及磷酸化水平的作用，以报告基因实验检测芒果苷对2215细胞内转录因子(activator protein-1，AP-1)活性影响，结果显示，芒果苷对2215细胞MAPK信号转导通路中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平无明显作用，但可以抑制JNK蛋白和其下游AP-1转录因子的活性，认为芒果苷通过MAPK信号转导通路抑制HBV在肝细胞内复制。

葡萄科蛇葡萄属药用植物大叶蛇葡萄(AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg.)具有保肝等作用[10]，陈梅玲等[11]将大叶蛇葡萄乙醇提取物作用于乙肝病毒DNA转染人肝癌细胞系2215细胞，以细胞病变(cytopathic effect，CPE)观察药物对2215细胞的毒性，用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定药物对培养8天的2215细胞分泌的HBsAg和HBeAg表达抑制作用。结果大叶蛇葡萄提取物半数中毒浓度(median toxic concentration，TC50)为250 μg/mL，最大无毒浓度(maximal atoxic concentration，TC0)为125 μg/mL；其对细胞HBsAg和HBeAg抑制的IC50为43.1 μg/mL、54.8 μg/mL，治疗指数(therapeutic index，TI)为5.8、4.7，表明大叶蛇葡萄乙醇提取物具有一定的体外抗乙肝病毒作用。

藤茶系葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand—Mazz)w．Y．Wang]的嫩茎叶，其主要成分是黄酮类化合物，含量约为45.52%。研究表明，藤茶总黄酮对2215细胞HBsAg、HBeAg的分泌有明显抑制作用[12]。双氢杨梅树皮素 (dihydromyricetin ampelosis，DHM)为藤茶总黄酮中含量最多的一种单体成分，郑作文等[13]接种2215细胞24h后，加入DHM培养，观察 DHM对细胞的毒性，在无毒质量浓度下，将药物加入2215细胞培养，ELISA法测定培养液中 HBsAg和 HBeAg水平。结果在最大无毒质量浓度下，DHM对2215细胞分泌 HBsAg及 HBeAg具有明显的抑制作用。对于 HBsAg，DHM IC50为 l7.7 μg/mL， TI为15.4；对于HBeAg，IC50为21.8 μg/mL，TI为12.5。DHM 对2215细胞分泌 HBsAg及 HBeAg有明显的抑制作用。

升麻具有清热解毒、升举阳气功能，主治头痛、牙痛、口疮、咽喉肿痛等证，体内外药理试验表明升麻中酚酸性成分具有明显抗病毒作用，刘方舟等[14]采用2215细胞模型进行体外实验，对细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA含量进行检测，评价升麻中提取物SMT 75%乙醇提取物、SMT总皂苷、SMT总有机酸体外抗乙肝病毒作用，结果显示升麻提取物对2215细胞HBeAg、HBV-DNA分泌有一定抑制作用，其中升麻总皂苷的0.018，0.036 g剂量组，升麻总有机酸的0.02 g剂量组对HBeAg、HBV-DNA分泌与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。

白背叶为大戟科植物Mallotusapelta(Lour.)Muel-Arg，临床常用于治疗肝炎。夏星等[15]以不同浓度的白背叶提取物培养接种24 h的2215细胞8 d，评价细胞形态学上的细胞毒性，酶联免疫法检测最大无毒浓度下的培养液中HBsAg和HBeAg水平，结果白背叶提取物对2215细胞HBeAg、HBsAg分泌有显著抑制作用，其中抑制HBsAg的IC50为8.61 μg/mL，抑制HBeAg的IC50为20.87 μg/mL。

爵床科植物六月青Goldfussiapsilostachys(C.B.Clarke ex W.W.Smith)Brem总皂苷成分可以抑制鸭乙肝病毒[16-17]。林兴等[18]以六月青总皂苷培养接种过的2215细胞，拉米夫定作为阳性对照，MTT法检测药物抗HBV作用，结果其对培养液中HBeAg分泌及HBV-DNA的复制具有明显抑制作用，呈显著的浓度-效应和时间-效应关系；对HBsAg的IC50为9.45 mg/L，TI为36.98，抗HBV作用显著。

2 中药复方

复方黄根片、复方三姐妹片等8个中药复方，是具有广西特色的抗慢性乙型病毒性肝炎的复方。邓家刚等[19]通过观察这8个中药复方对2215细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，筛选出体外可能抗乙肝病毒的复方。实验应用MTT法对8个中药复方进行细胞毒性实验，在无毒浓度下分别检测8个中药复方对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用。复方黄根片最TC0为1375 μg/mL，对细胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分别为29.85%，89.99%；复方三姐妹片的TC0为1250 μg/mL，对细胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分别为1.69%，80.78%；复肝汤的TC0为730.05 μg/mL，对细胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分别为33.09%，40.98%；护肝解毒丸的TC0为2700 μg/mL，对细胞分泌的HBsAg没有作用，对HBeAg抑制率为64.16%；达肝清颗粒的TC0为626.2 μg/mL，对细胞分泌的HBsAg，HBeAg抑制率分别为3.70%，43.83%；柴胡四草汤的TC0为278.91 μg/mL；壮肝散的TC0为3281.25 μg/mL；健脾利湿方的TC0为976.56 μg/mL。结果发现复方黄根片、复方三姐妹片、护肝解毒丸、复肝汤对HBeAg有较强的抑制作用，对HBsAg的抑制作用比较弱；达肝清颗粒对HBeAg有一定的抑制作用，对HBsAg的抑制作用比较弱；柴胡四草汤、壮肝散、健脾利湿方对HBeAg，HBsAg几乎没有抑制作用。

海珠益肝胶囊的组方主要由叶下珠、海藻等中药组成，具有清热解毒、化痰消瘀之功效，经临床应用有良好的疗效[20]。宴雪生等[21]通过细胞毒性实验以确定对2215细胞无毒性作用的最高药物浓度，直接加药物到细胞培养液中，用固相放射免疫方法测定其HBsAg、HBeAg含量。结果表明海珠益肝胶囊TC0<1.25 mg/mL，海珠益肝胶囊有明显抑制HBsAg、HBeAg的作用，各浓度间存在量效关系，其中对HBeAg的作用优于对HBsAg的作用。得知海珠乙肝胶囊对2215细胞HBV标志物有显著的抑制作用。

复方肝舒康由马鞭草、移星草、巴戟天、人参等十二味中药组成，临床治疗病毒性肝炎有显著疗效。李虹霖等[22]以复方肝舒康各提取部位作用于HBV转染的2215细胞，酶联免疫法检测其对HBsAg和HBeAg的抑制作用，结果复方肝舒康乙酸乙酯提取物对HBsAg半数有效浓度IC50为14.0 μg/mL，治疗指数26.7；对HBeAg的IC50为19.7 μg/mL，治疗指数19.04。说明复方肝舒康抗HBV作用明显，其作用的物质基础是乙酸乙酯部位。

蛇黄肝炎合剂由白花蛇舌草、田基黄、蒲公英、黄芪等九味药物组成，具有清热解毒、益气护肝等功效，孔祥廉等[23]以HBV转染的人2215细胞株为靶细胞，通过体外细胞培养实验观察其对HBV分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用，结果蛇黄肝炎合剂在1:16倍稀释时对细胞的破坏率为63.49%，无毒浓度1:32倍稀释下能抑制HBsAg达64.83%，抑制细胞分泌HBeAg达86.1%，提示本药物为2215细胞分泌HBsAg和HBeAg抑制作用显著。

壮药汗衣台为防己科植物皱波青牛胆的(Tinosporacrispa(L.)Miers)的藤茎。该属植物在印度、泰国等东南亚国家被广泛药用，具有通经活血、清热排毒等作用[24]。廖丹等[25]以不同浓度汗衣台及其配伍药孵育2215细胞，ELISA法测定分泌HBsAg和HBeAg含量，荧光定量检测HBV-DNA，结果复方(P<0.01)与汗衣台单用(P<0.05)均有抑制HBeAg以及HBV-DNA分泌的作用。

3 含药血清

中药血清药理学方法是近年来兴起的一种适合中药特点的更科学的中药药理学实验方法。它可防止中药制剂本身的理化性质对实验的干扰，还能模拟反映中药在胃肠道消化吸收、再经生物转化、最后产生药理效应的真实过程，并代表了药物在体内产生作用的真正有效成分，尤其是适用于中药及中药复方化学成分复杂的特点，由于体外试验存在着一定的局限性，体内试验模拟难度大，近年来已有越来越多学者趋向于利用血清药理学对中药抗HBV的作用进行研究。

李刚等[26]采用酶联免疫吸附试验法检测藤茶总黄酮含药血清对2215细胞分泌的HBsAg和HBeAg的抑制作用。藤茶总黄酮含药血清能显著抑制2215细胞HBsAg、HBeAg的分泌，20%、10%藤茶总黄酮含药血清对2215细胞HBsAg和HBeAg的分泌有非常显著的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

壮药依肝达是通过长期的民间临床观察而拟定的治疗急慢性乙型肝炎和肝硬化的验方， 主要由壮族民间草药饭汤子、田基黄、三姐妹等组成，，具有清热解毒、利湿退黄和促进肝功能恢复之功效，临床疗效显著。梁宁等[27]采用ELISA法检测依肝达含药血清对2215细胞分泌的 HBsAg和HBeAg的抑制作用。实验结果表明，依肝达含药血清 (20%、10%)明显降低2215细胞分泌的 HBsAg、HBeAg抗原水平(P< 0.01)，与阳性组无明显差别。

苦玄参为玄参科植物苦玄参(PicriafeltarraeLour)的干燥全草，曾金强等[28]以苦玄参不同提取部位含药血清作用于2215细胞，用酶联免疫法测定HBsAg和HBeAg水平，发现各提取部位对HBsAg均有抑制作用；乙醇提取部位、水提取部位等极性较大成分对HBeAg的抑制作用明显，抑制率最高达80%。

4 讨论

目前对于乙肝病的治疗，研究方法主要集中在抗病毒上。HBV是一种较为严格的嗜肝DNA病毒，由于病毒黏附以及DNA转录和复制对宿主有严格的要求，HBV只感染人类和类人猿。对HBV的研究由于缺乏合适的可利用的动物模型而受到一定限制[29]。现阶段中药抗HBV效果大多利用HepG2215细胞株和以嗜肝DNA病毒感染动物这2种模型来评价[30]，应用2215细胞作为药物体外筛选模型，与以往的体内试验相比，该方法简便可行，可以为抗HBV药物的筛选从另一个角度提供一定的信息。但体外实验研究结果不能完全反映体内所特有的免疫调节和体内代谢对药物效果的影响，进一步证实药物抗病毒作用还须结合体内实验来确定。笔者认为，抗乙肝病毒的体外研究应通过中药化学、分析化学、生物化学、免疫学、细胞药理学及分子生物学等多学科理论和技术加以研究，并紧密结合中医药的基础理论，以使其更系统化。

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(编校：王冬梅)

Research progress of 2215 cell in hepatitis B virus resistance tests for traditional Chinese medicine

FU Chao1,LI Chen2

(1.Qingdao Center for Food and Drug Control, Qingdao 266071, China; 2.Qingdao FuWai Hospital of Cardiovascular Disease, Qingdao 266034, China)

Using 2215 cells for drug screening in vitro model at present has developed to the mature stage.According to the different ways to deal with existing experiment of drug classification.In this paper, the research status of 2215 cells in hepatitis B virus (HBV) resistance experiment for Chinese herbal medicine, Chinese medicine extract, proprietary Chinese medicine and the drug-containing serum were summarized to provide the reference for research and development of traditional Chinese medicine for anti HBV .

2215 cells; traditional Chinese medicine (TCM); anti-HBV; research progress

傅超，男，硕士，主管药师，研究方向；药品检验，E-mail：alexandar_2026@sina.com。

R965.1

A

1005-1678(2015)02-0180-04