化学诱导的糖尿病视网膜病变动物模型研究进展

王 晗 罗向霞 李 欢 冯玉沛

化学诱导的糖尿病视网膜病变动物模型研究进展

王 晗1罗向霞2李 欢1冯玉沛1

糖尿病视网膜病变动物模型的制备方法有多种，其中化学诱导的动物模型因其来源简单、方法简便、经济、并发症少等优点而被广泛应用。本文就现在常用的化学诱导的糖尿病视网膜病变动物模型的构建、药物类别、使用剂量、给药途径、成模标准、动物种属、成模时间等方面进行阐述，同时简要说明体内成像技术在这些模型中的特征性表现，为研究人员了解以及选择合适的动物模型进行研究提供参考。

糖尿病视网膜病变；化学诱导；动物模型

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是由糖尿病（diabetes mellitus，DM）引起的一种眼部慢性并发症，同时是世界各地糖尿病患者致盲的主要原因之一。对于DR的了解，只能通过深入对其发病机制的研究来实现，然而，研究过程复杂而漫长，不能轻易将人类作为受试者。为了研发新的更好的药物及防治方法，动物模型在此过程中至关重要。根据动物模型的不同制备方法，我们将常用的DR模型分为胰腺部分切除模型、转基因模型、自发性遗传性模型以及化学物质诱导性模型4种。其中化学物质诱导性模型通过化学药物破坏胰岛β细胞，导致胰岛素生成减少，引起动物糖尿病。其诱发的糖尿病模型因具有造模时间短，发病率高，病情发展较统一等优点而被广泛应用，本文就该动物模型的相关情况综述如下。

1 造模试剂

我国目前常用的化学诱导试剂主要有四氧嘧啶（alloxan，ALX）和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）等。

1.1 四氧嘧啶（ALX）

自从1943年ALX被发现能诱导家兔胰岛β细胞坏死以来，已被作为糖尿病动物模型诱导剂使用至今〔1〕。ALX诱导的糖尿病动物模型在病理生理上与人类1型糖尿病相似。其价格便宜，来源广泛，但对肝肾危害较大，动物致死率较高。另外，值得注意的是，大剂量ALX可使犬、猫等动物产生永久性糖尿病，但部分啮齿类动物（如鼠）形成的糖尿病可自发缓解。

1.2 链脲佐菌素（STZ）

Rakieten等〔2〕在1963年就指出STZ可致狗和大鼠患糖尿病。STZ对动物肾脏、免疫组织等均有毒性，但较ALX轻。链脲佐菌素可诱导1型或2型糖尿病，其中2型糖尿病成模率较四氧嘧啶高，且成模后能维持稳定的高血糖状态〔3〕。

由于STZ与ALX有不同的优缺点，有研究人员尝试两药联合诱导，减少二者剂量，既降低了单用ALX对肝、肾的损害，又弥补了单用STZ剂量过大导致动物死亡或剂量过小所致成模率低的不足。

1.3 其他药物

除了常用的STZ及ALX外，也有研究人员使用其他试剂或者多种试剂联合应用成功诱导了糖尿病动物模型。肖乐等〔4〕在注射ALX前5 min经兔耳缘静脉注射地塞米松2.5 mg（0.5 ml），比单纯注射ALX的动物成模效果佳。梁志峰等〔5〕的实验结果显示，中剂量（100 mg/kg腹腔注射×2）ALX配伍高剂量（2 mg/kg腹腔注射×4）阿托品制作糖尿病动物模型效果较好，能显著提高成模率，降低死亡率并使血糖维持较高且稳定的水平。Sasaki等〔6〕给ICR新生小鼠皮下注射谷氨酸钠2 mg/g，顺利诱发糖尿病。张小华等〔7〕用高脂饲料加地塞米松隔日腹腔注射，成功建立实验性胰岛素抵抗大鼠模型。另外，有实验结果〔8〕显示，STZ（30 mg·kg-1·d-1）及弗氏完全佐剂（CFA）0.1 ml联合腹腔注射，亦可成功诱导糖尿病模型，长期可出现晶状体、视网膜等部位的眼部并发症。以上方法由于操作繁琐复杂，或技术要求高，或造模周期过长等，均未能大范围普及，但不失为可选的造模方法，研究人员可根据自身条件选取合适的试剂。

2 用药剂量

无论是ALX还是STZ等其他诱导剂，目前均没有统一的剂量标准。对此，研究人员进行了一系列探索，为求以最小的剂量诱导出最成功的模型。

2.1 使用ALX诱导

代小思等〔9〕采用150～160 mg/kg剂量的ALX对雌性SD大鼠腹腔注射，建立了成模率低，但稳定且长期存活的1型糖尿病动物模型。李羡筠等〔10〕将SPF级雄性昆明种小鼠禁食后，以不同剂量腹腔注射ALX。结果显示，180 mg/kg剂量的成模率和死亡率均高于160 mg/kg剂量，但后者造模血糖平稳上升，维持时间长。因此认为160 mg/kg剂量注射后造模效果比180 mg/kg剂量好。另外亦有诸多学者〔11〕表示运用中等剂量成模率高，由此我们可以假设，对于一般品系的啮齿类动物，腹腔注射ALX，160 mg/kg为最适剂量。

2.2 使用STZ诱导

STZ的用量一般波动在50～60 mg/kg之间。周琳等〔12〕按60mg/kg单次剂量对SD大鼠腹腔注射，造模成功率仅为82.5%。郭学军等〔13〕将Wistar大鼠随机分为中剂量组（55 mg/kg）和高剂量组（65 mg/kg），高剂量组成模率不及中剂量组，且死亡率高。但中剂量组成模率亦不及一些文献报道的可达80%～90%。由此可见，STZ的用量仍没有固定标准，笔者推断这种不确定性主要有三方面因素。第一，STZ的化学性质不稳定，配制过程中要求避光低温保存，且必须现配现用，操作不当，易失活影响药效；第二，实验大鼠间个体差异较大，存在实验室环境、地域差别等；第三，腹腔注射药物时误入皮下或腹腔脏器导致药物流失〔13〕。

3 给药途径

啮齿类动物模型诱导剂给药途径一般有尾静脉注射、皮下注射和腹腔注射。何学令等〔14〕将SD大鼠分别给予静脉和腹腔两种给药方式，静脉给药相对腹腔给药动物的症状及血糖水平稳定性均较理想。因此，制作糖尿病模型采用静脉给药效果优于腹腔给药。少数研究人员〔11〕采用皮下注射方法，将SD大鼠皮下注射ALX水溶液，亦能顺利造出成模率高，死亡率低，稳定的模型。经查阅文献发现，尽管静脉注射的用量较小，成模率高，但由于其操作较腹腔注射、皮下注射技术要求高，同时皮下注射试剂用量较大，实验人员最常用的方法仍为腹腔注射。

4 成模标准

目前常用的成模标准主要考虑空腹血糖以及尿糖两方面，一般为诱导剂注射后3 d空腹血糖值≥16.7 mmol/L，尿糖++～+++提示造模成功。但部分研究人员〔15-18〕认为以11.1 mmol/L、12 mmol/L、13.9 mmol/L、14 mmol/L等作为标准较为合适。而对于广西巴马小型猪，相关研究者则认为连续2次空腹血糖大于6.3 mmol/L即可。成模血糖水平虽然不尽相同，但都是根据人体正常血糖值与动物正常血糖值对比换算而得出，理论依据基本相同。有学者〔13〕经过研究发现，口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）在动物实验中比空腹血糖监测更有诊断意义，不易造成漏诊。但鉴于空腹血糖值测定简便易行，仍然为多数研究者所采用。

5 造模动物种属

郭学军等〔13〕通过腹腔注射STZ制作SD和Wistar大鼠糖尿病模型，注射相同剂量，Wistar大鼠成模率和死亡率均高于SD大鼠。唐东红等〔19〕则选用恒河猴进行糖尿病视网膜并发症造模，成功诱导出不同程度的糖尿病视网膜并发症。近期，有学者指出〔20〕，虽然啮齿类动物具有和人类视网膜病变类似的病理变化，但是由于啮齿类动物视网膜没有黄斑，不能作为糖尿病性黄斑水肿的动物模型。其慢性炎性病变亦不能与人类炎症反应很好地吻合，所以他们尝试选用鸡胚作为受试动物来研究视锥细胞的功能，以更新此领域的研究认识。

荧光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）是检查DR血管病变的重要方法，为了解有或无色素动物FFA图像及视网膜血管消化铺片的差异，周伟等〔21〕使用MicronⅢ视网膜影像系统，对不同品系DR大鼠模型进行比较。结果发现，BN大鼠由于视网膜色素上皮细胞黑色素的存在，消除了背景荧光的干扰，更容易发现糖尿病大鼠的视网膜血管改变，FFA成像效果明显优于SD大鼠，提示可用BN类有色素大鼠替代无色素大鼠（SD或Wistar）进行DR研究，若仅需判断视网膜血管有无异常时，可采用FFA活体检查技术替代离体的视网膜血管消化铺片、荧光铺片等方法，以减少实验动物的数量，提高实验效率。

6 成模时间

当前的DR动物模型均建立在糖尿病动物模型基础上，但并不能认为所有造模成功的糖尿病动物均能出现DR。有研究表明〔22〕，STZ注射4周后，部分实验大鼠的视网膜出现DR背景期的改变，与周伟等〔21〕人的观察结果一致。但刘玉等〔23〕发现，成模后2个月，C57BL/6小鼠仍未发现视网膜血管改变，与上述结果截然相反。经过4个月或更长病程，有研究人员〔24〕发现实验组大鼠的视网膜组织学表现显示视网膜组织水肿，细胞排列紊乱。在细胞层面上，宋晗等〔25〕人发现Wistar糖尿病鼠5个月组视网膜水肿较3个月重，内、外颗粒层细胞排列紊乱，界线消失，神经节细胞数量减少，神经节细胞层和颗粒层空泡样变性明显，可见血管样结构。血管形态方面，段慧慧等〔26〕将SD大鼠造模成功后饲养6个月，视网膜血管基底膜增厚，毛细血管排列紊乱，管腔粗细不等，或节段膨大或退化，血管管腔闭锁形成无细胞毛细血管。但未见毛细血管瘤。

由以上研究结果可见，成功诱导动物致糖尿病后，并不能表示已有眼部并发症发生。血糖水平、控制程度、个体差异等的不同，DR出现及发展的时间也不同，我们无法精确地计算。由于动物患糖尿病后存活时间短，而常规糖尿病视网膜病变造模周期长且不可预期，所以董白霞等〔27〕采用了STZ腹腔注射造成SD大鼠糖尿病模型1个月后行玻璃体注射血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的方法制造增殖性糖尿病眼底病变模型。大鼠不仅出现了临床中常见的非增殖期病变，还观察到了视网膜新生血管这种增殖期糖尿病性视网膜病变特有的体征。这种方法大大缩短了造模时间，保证了动物的成活率，为研究增殖性糖尿病视网膜病变提供了快捷方法。

综上，我们可以看出，对于不同时间，不同研究人员以及不同的实验动物，实验结果不尽相同甚至截然相反，笔者认为这种结果与实验动物的个体差异以及实验人员的操作等因素密切相关。

7 小结

动物疾病模型的设计原则，也是创新和选用动物疾病模型的出发点，相似性、可重复性、可靠性、适用性、可控性、易行性和经济性均是需要考虑的问题。我们应对目前可用的DM模型进行系统的标准化研究，确定各种模型的差异性、相似性与可重复性，包括各种结构和功能发生改变的频率、程度和时段，以及测量评估的标准。总之，研究者应明确不同类型动物模型各自的特征和局限性，应根据研究目的、实验要求和经费等具体情况，选择合适的动物模型〔28〕。另外，在实验操作过程中，应严格要求，操作规范，以规避各种由于研究人员操作不当等造成的失误，以免影响实验结果。

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Research progress of chemical induction diabetic retinopathy animal models

WANG Han，LUO Xiangxia，LI Huan，et al.Gan-su University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，Gansu，China

There are many different kinds of preparation methods to make animal models of diabetic retinopathy.Chemical induced animal models are widely used because of its simple source and method，cheap and less complications.This article showed the method，drug category，dosage，drug-delivery way，standards，animal species and time for success，etc，and briefly introduced the expression by body characteristic imaging technology in these models.It provided the reference for researchers to understand and choose the suitable animal model for research.

diabetic retinopathy；chemical induction；animal models

R774.1

A

1002-4379（2015）04-0297-03

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2015.04.020

1甘肃中医学院（2014级中医五官科学研究生），兰州730000

2甘肃省中医院，兰州730050

罗向霞，E-mail:279089608@qq.com