骨桥蛋白及其受体CD44v对肿瘤侵袭调控的研究进展

2015-01-23孙冰生张真发

中国肺癌杂志 2015年11期

孙冰生张真发

骨桥蛋白（osteopontion,OPN）和CD44v是近年来研究较热门的肿瘤相关蛋白，OPN是一种分泌型非胶原性富含唾液酸的糖蛋白，在多种组织细胞广泛表达。OPN可通过改变细胞骨架、降解胞外基质、刺激表皮生长因子、淋巴细胞伪装、激活癌基因Ras等途径促进肿瘤细胞的转移；CD44v可通过降解胞外基质、改变细胞形态、免疫逃避等作用促进肿瘤侵袭。目前认为OPN通过结合胞膜上整合素和CD44受体，激活胞内相关信号通路，增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）、尿激酶型纤溶酶原激活因子（urokinase type plasminogen activator,uPA）、透明质酸（hyaluronic acid,HA）、血管生成因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等表达，促进肿瘤侵袭转移[1,2]。最近我们对非小细胞肺癌的研究[3,4]表明OPN及其受体CD44v6与肿瘤侵袭转移密切相关。

1 OPN的结构

人OPN基因定位于染色体4ql3，约8 kb的单拷贝基因，由7个外显子（其中6个包含编码序列）和6个内含子构成并且发现其外显子有3个单核苷酸多肽性区域；OPN基因启动子区域包含一个TATA盒、一个反向的CCAAT盒、一个GC盒及多种转录因子的结合位点[5]。

OPN是一种带负电荷具有亲水性的分泌型酸性糖蛋白，其相对分子量约44 kDa-75 kDa，具体大小主要由翻译后修饰程度决定；约含300个氨基酸残基，其中天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸残基约占总氨基酸的一半[6]。人OPN通过转录水平的选择性剪接产生三种亚型：OPN-a、OPN-b、OPN-c，其中全长形式的OPN-a，包含所有外显子；OPN-b mRNA序列缺少外显子5；而OPN-c mRNA序列缺少外显子4。三种亚型在多种类型的肿瘤中均有表达，但尚未阐明具体病理意义及功能[7]。OPN一般由信号肽序列、7个-10个连续天冬氨酸序列、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Glu-Asp,RGD）结构域、整合素α9β1/α4β1结构域、凝血酶切割位点、钙离子结合位点和肝素结合位点构成。OPN可被凝血酶裂解为2个功能区：N端片段经磷酸化后依赖RGD基序与整合素受体结合，介导细胞的迁移、趋化和粘附，同时具有抗凋亡和免疫逃逸功能；C端片段不依赖RGD基序与CD44受体结合，介导细胞内信号传导，提高粘附功能，并参与免疫逃逸和淋巴细胞归巢[1]。OPN经凝血酶切割后，同时暴露非依赖RGD基序与α9β1/α4β1结合的SVVYGLR粘附序列[8]。

2 OPN的主要受体

2.1 整合素家族整合素是由α和β亚基通过非共价键形式连接而成一种细胞表面糖蛋白，其中与肿瘤转移相关的主要是α9β1和αvβ3。OPN主要通过识别RGD结构域与整合素受体结合，介导细胞粘附与迁移，并改变宿主免疫力[9]；而α9β1对RGD无依赖性，可能通过识别SVVYGLR位点介导细胞与细胞和细胞与基质间的相互作用，在血管生成中发挥作用[8]。

2.2 CD44结构与功能 CD44是一种高度异质性细胞表面跨膜糖蛋白，广泛分布于炎细胞、上皮细胞、软骨细胞、纤维母细胞及肿瘤细胞等；其相对分子量约80 kDa-200 kDa，主要由选择性剪切和蛋白修饰程度决定。CD44胞膜外区具有与透明质酸结合的能力，也是其发挥生物学功能的重要区域；跨膜区由21个疏水性氨基酸组成；胞质区可被蛋白激酶C磷酸化，参与细胞内信号传导。人CD44基因位于11号染色体短臂，由20个外显子构成。根据外显子的表达方式不同可分为标准型CD44（CD44s）和变异型CD44（CD44v）。某些CD44v，如CD44v6已作为肝癌、乳腺癌、结直肠癌及胃部肿瘤转移判断的标志。与整合素家族不同，CD44主要通过氨基酸缩聚反应（CD44v6）或肝素桥接（CD44v3,CD44v9）与OPN结合产生趋化、抗凋亡及粘附等作用[10]。

CD44v主要出现在机体的病理过程，其中CD44v6在肿瘤进展中发挥重要作用，其机制可能是：①促进肿瘤细胞与基底膜粘附蛋白及IV型胶原酶的粘附，为胞外基质的降解创造条件；②作为受体介导HA与骨架蛋白相结合，参与细胞伪足的形成，引起细胞形态和游走性改变，促使癌细胞转移；③CD44v6高表达的癌细胞可获得淋巴细胞伪装，逃避免疫系统的识别和杀伤；④促进肿瘤间质细胞释放蛋白水解酶[11]。

3 OPN在肿瘤侵袭、转移中的作用

肿瘤细胞通过自分泌产生OPN，促进自身粘附、侵袭、转移，与肿瘤细胞恶性表型密切相关。包括：对细胞骨架进行调节，降解胞外基质，参与肿瘤细胞粘附、趋化和迁移；促进肿瘤血管生成；逃避宿主免疫反应；抑制肿瘤细胞凋亡等。

3.1 调节细胞骨架，降解胞外基质，促进细胞运动 OPN通过RGD序列与整合素受体结合，引起聚集粘附激酶磷酸化，进而激活Ras和丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号转导途径，促进细胞内OPN与HA-CD44-ERM（埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白）结合成复合体，改变细胞骨架，参与成纤维细胞的迁移、巨噬细胞的激活和肿瘤细胞的转移[12]。有研究[13]表明Ezrin蛋白可直接或间接与CD44v6等结合，进一步来调节肿瘤细胞的粘附性，影响肿瘤的侵袭、转移。OPN与整合素受体结合，通过核因子κB、AKT等信号转导途径促进MMP2、MMP9、uPA的表达，从而降解胞外基质[10]；还可通过c-Src途径活化细胞粘附分子，促进肿瘤细胞趋化粘附和迁移[14]。

3.2 促进肿瘤血管生成，逃逸宿主免疫，抑制细胞凋亡 OPN可使VEGF表达上调，而VEGF可通过激活PI3K/AKT等途径刺激OPN的表达。Ito等[8]研究证明OPN的SVVYGLR序列能有效促进血管内皮细胞的粘附和迁移。Chakraborty等[15]研究表明OPN结合整合素受体，启动肿瘤血管的生成，在此过程中依赖于VEGF的作用。Dai等[16]发现OPN通过激活内皮细胞PI3K/AKT和ERK1/2信号诱导血管生成。最近报道OPN可降低环氧酶2活性、抑制巨噬细胞NO合酶的分泌，避免NO对肿瘤细胞的毒性作用，从而使癌细胞在血液循环中得以存活[17]。OPN RGD区域通过激发NF-κB通路和促进聚集粘附激酶磷酸化来抑制细胞凋亡[9]。

3.3 促进上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）越来越多证据[18]表明肿瘤细胞发生EMT后能获得侵袭表型，癌细胞进入周边基质，形成有利于转移形成的微环境，并最终促使转移的发生。有研究[19]表明OPN上调EMT进而促进乳腺癌细胞侵袭转移。Bhattacharya等[20]研究肝癌移植小鼠模型时发现OPN通过调控EMT促进肿瘤生长。

4 OPN-CD44v相互作用与肿瘤侵袭转移

Gao等[21]采用蛋白印迹法检测HepG2肝癌细胞株中OPN对CD44v6的影响，结果发现OPN上调CD44v6在胞膜上的表达，OPN这种作用的实现依赖于酪氨酸激酶活性和与αvβ3结合的能力；同时随着CD44v6的升高，癌细胞粘附基质的能力增强从而增加肝癌的转移潜能。另有研究[22]表明CD44+结直肠癌细胞能促进巨噬细胞OPN的分泌，进而通过激活JNK通路促进癌细胞生长；敲除CD44后，癌细胞分泌的OPN减少。Kumar等[23]研究表明过表达的OPN能促进宫颈癌细胞生长；短发夹RNA沉默OPN表达，OPNCD44调控的MAPK激酶依赖性P38未激活进而抑制癌细胞生长。

5 OPN调控肿瘤的相关信号途径

5.1 PI-3K/Akt/NF-κB通路（磷脂酞肌醇3激酶/蛋白激酶B/核因子通路） AKT作为PI3K下游靶蛋白，是信号转导途径中的重要激酶。PI3K-AKT介导细胞侵袭和血管生成作用[24]。OPN与整合素αvβ3结合后可诱导NF-κB活化从而促进MMP2和uPA的表达，诱发肿瘤血管的生成及胞外基质的降解[5]；OPN通过结合α9β1增强NF-κB依赖的环氧酶2的表达促进肿瘤血管形成[17]。

5.2 c-Src/EGFR/ERK通路（c-Src/表皮生长因子受体/胞外信号调节激酶通路） c-Src属于非受体型蛋白酪氨酸激酶家族，参与调控整合素受体的下游信号通路。OPN与αvβ3结合可诱导c-Src的活化和EGFR的磷酸化，进而促进胞外信号调节激酶的活化，将信号传导至胞核；c-Src还可诱导核转录因子激活蛋白1的活化及uPA的分泌，促进胞外基质的降解、肿瘤血管的生成。此外，c-Src还能活化PI3K、Ras-MAPK、磷脂酶C等激酶和细胞粘附分子，调控细胞的粘附及转移[24-26]。

5.3 NIK/MAPK/IKK途径（核因子诱导激酶/丝裂原激活蛋白激酶/ NF-κB抑制蛋白激酶途径） NIK属于丝裂原激活蛋白激酶家族，在基因表达调控和胞质功能活动中发挥重要作用。OPN与αvβ3结合后，NIK发生磷酸化，活化的NIK与IKKα或IKKβ相互作用，激活IKK进而促发NF-κB通路。此外，活化的NIK还参与OPN诱导ERK激酶MEK1的磷酸化，活化的MEK1又可诱导转录因子AP1的活化，最终促进uPA、MMP的分泌[27]。

5.4 OPN-CD44 转导途径 OPN通过与CD44受体相互作用激活PLC-γ/PKC/PI3k信号通路，促进细胞存活和细胞运动。OPN与CD44结合，活化第二信使PLC-γ，促使蛋白激酶C磷酸化而激活PI3K，诱导其下游分子Akt的磷酸化，进而调控细胞周期、促进细胞迁移；此外，OPN加强活化的Akt与IKK相互作用，诱导IKK活化，降解NF-κB抑制剂IκBα，从而促发NF-κB通路。Teramoto等[27]发现OPN与CD44结合并同时高表达于肿瘤组织，通过OPN-CD44-Ras-MAPK途径促进癌细胞趋化粘附和迁移，激活的Ras活化Raf（MAPK kinase kinase,MAPKKK）进而激活MEK（MAPK kinase,MAPKK）最终导致胞外信号调节激酶ERK激活，从而在肿瘤复发与转移中起重要作用。研究[28]表明OPN通过结合其受体CD44激活c-jun-NH2激酶信号，促进大肠癌细胞的克隆形成。