牦牛非编码RNA及在遗传学中的教学初探

欧江涛，梁慧星，赵卫红，张思源，柴志欣，钟金城

（1.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；2.西南民族大学青藏高原研究院）

牦牛非编码RNA及在遗传学中的教学初探

欧江涛1，梁慧星1，赵卫红1，张思源2，柴志欣2，钟金城2

（1.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；2.西南民族大学青藏高原研究院）

非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）虽不表达蛋白质，但其在细胞生命活动中起着重要的功能，主要在基因转录水平、转录后水平和翻译水平通过与靶标相互作用而发挥调控作用，涉及一系列生命过程如细胞增殖、发育、分化、代谢、信号转导和免疫调控等，现已成为生命科学研究领域的前沿热点之一。文章从非编码RNA及其在牦牛中的研究进展以及在遗传学中的教学应用几个方面进行了综述，以期为牦牛遗传育种和遗传教学提供参考。

牦牛；非编码RNA；遗传育种；遗传教学

自20世纪90年代起，大规模开展了人类和其他模式生物的全基因组测序和比较基因组研究，海量的基因组序列数据表明，DNA上编码蛋白质区域（编码区）只占人类和其他高等动、植物基因组的极小部分，而在人类，仅约1.5%的DNA序列最终编码生成蛋白质，其余部分都为不编码区域［1］。对于占据基因组大部分的非编码区，在过去普遍被认为是“垃圾DNA”，可是随着科学技术的飞速发展，越来越多的研究数据显示，在这些区域暗藏着大量的功能元件，2010年《科学》杂志（Science）在评选本世纪前10年的十大科学突破时，首先提到的就是基因组中的暗物质［2］。其中，基因组非编码序列可以表达生成大量的非编码RNA（ncRNA），越来越多的事实证明，作为暗物质成分之一的ncRNA，许多具有重要的生物功能，是有待挖掘的巨大生物宝库，已成为生物学领域的研究热点。作者通过多年的研究积累与沉淀，并查阅了大量相关文献资料，对ncRNA的研究概况、牦牛ncRNA研究进展及在遗传学中的教学应用等进行综述，以期为牦牛遗传育种和遗传教学提供参考。

1 非编码RNA的研究概况

1953年Watson和Crick发现DNA分子的双螺旋结构，之后几年间对遗传信息传递规律进行了探索与解码，于1958年Crick提出了中心法则，建立起基因到蛋白质之间遗传信息的传递机制。1961年Jacob和Monod首次提出了信使RNA（mRNA）的概念，并指出mRNA在蛋白质翻译过程中作为遗传信息传递者的中心作用。在中心法则确立的随后50多年，人们的认识主要集中在：遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，完成遗传信息的转录和翻译过程。直至2001年人类基因组计划（human genome project，HGP）的完成，科学家惊奇地发现仅占人基因组中1.5%的核苷酸序列编码蛋白质，而这些极少的编码序列不足以完整地解释高等生物复杂的生命活动。因此，自2003年美国国立卫生研究院人类基因组研究所又启动了“DNA元件百科全书（encyclopedia of DNA elements，ENCODE）”计划，它的主要目标是研究人类基因组98.5%的非编码区DNA元件的种类、分布、功能、对染色质重塑的影响、与DNA甲基化与去甲基化和组蛋白乙酰化与去乙酰化等多种表观修饰间的关系等［3］。经多年研究结果表明，大约80%的DNA序列都能转录成RNA，其中绝大部分为非编码RNA，它们数目巨大、种类繁多，并参与了细胞的增殖、分化、凋亡、代谢、信号传导、免疫调控、干细胞的维持和胚胎的发育等几乎所有生理或病理过程的调控。

目前，由于ncRNA在序列、结构以及生物功能上的高度异质性，其种类繁多，存在多种分类方法，通常简单分为持家和调节RNA两大类。对持家ncRNA而言，其在维持细胞正常功能中必不可少，这些RNA主要包括参与初级转录物加工的核内小RNA（small nuclear RNAs，snRNA）、核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、核糖核酸酶P RNA（ribonuclease P RNA，RNaseP RNA）和引导RNA（guide RNA，gRNA），参与翻译的转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA），以及翻译控制的RNA（tmRNA）等；而调控性ncRNA参与基因转录调节、染色体结构调节、蛋白质翻译调节、RNA和蛋白质功能调节等，主要包括顺式反义RNA（cis-antisense RNA，cis-as-RNA）、反式反义RNA（trans-antisense RNA，trans-asRNA）、与Piwi蛋白相互作用的piRNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）和启动子相关 RNA（promoter-associated small RNA，pRNA）等。此外，较为常见的分类方法还根据ncRNA的长度大小，可分为较小长度的微小RNA（miRNA、piRNA和siRNA），中等长度的ncRNA（snoRNA和pRNA）和较大长度的ncRNA（lncRNAs）等［4-5］。

在真核生物中，miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′非翻译区（UTR）完全或部分配对结合以降解靶mRNA或阻碍其翻译，它在生物进化历程中相当保守，广泛存在于植物、动物和真菌中，表达具有时空特异性，参与各种各样的调节途径，主要包括细胞增殖与凋亡、器官发生与发育、造血过程、肿瘤发生、脂肪代谢、生殖发育、复杂疾病的发生与转归、细菌与病毒的免疫调控等［6-8］；piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与PIWI亚家族成员Piwi或AGO3蛋白质形成复合物来调控基因沉默，在抑制转座子活性、维持基因组稳定性、参与异染色质的形成、参与表观遗传调控和生殖发育调控等过程中起重要作用［9-10］；启动子相关RNA（pRNA）主要通过调节DNA甲基化而发挥作用；lncRNA通常指长度大于200个核苷酸的RNA转录本，参与转录水平的基因表达调控，转录后水平的信使RNA编辑与加工，参与翻译调控和表观遗传调控等［11-12］；小干扰RNA可抑制或降解靶mRNA和抑制转座子的活性，参与组蛋白的修饰，与异染色质的形成有关等。

在原核生物中，细菌非编码RNA（ncRNA）一般指大小为50～500个碱基，并以RNA形式发挥生物学功能的一类RNA分子，可分为顺式反义RNA、反式反义RNA和核糖开关等类型，广泛存在于各种细菌中，其主要通过碱基配对识别靶标mRNA，调控mRNA的翻译或稳定性，在转录后水平调节基因的表达，部分ncRNA通过与蛋白质相互作用而影响蛋白功能。近年来，相关研究表明，细菌ncRNA的生物学功能，集中体现在以下几个方面：①参与细菌对于环境压力的调节性反应，减少环境变化对细菌的损害；②参与细菌生化代谢的调节，维持细菌内铁含量的平衡和糖代谢的稳定；③参与细菌外膜蛋白的表达调控，与细菌的毒性密切相关；④参与细菌的群体感应过程，调控细菌之间的信号交流，控制细菌重要生命活动的实施；⑤参与细菌毒力因子的调控，有效地促进细菌生长、繁殖、黏附和扩散等［13-15］。

目前，关于调控ncRNA筛选和鉴定的方法，可以分成两大类：一类是基于生物信息学的计算机预测方法；另一类是基于实验室的检测分析方法。现阶段主要包括RNA标记和染色、功能性遗传筛选、蛋白质共纯化、基因芯片检测、鸟枪克隆法、生物信息学搜寻、基因组SELEX和转录组测序等方面。RNA标记和染色是最早用于寻找ncRNA的方法，但其不能区分功能ncRNA、rRNA和tRNA；功能性遗传筛选能直接鉴定ncRNA功能，但可能无法发现只在特定压力条件下发生调控或转录活化抑制的ncRNA；蛋白质共纯化能够指示出所筛选的ncRNA与蛋白质的相互作用和活性形式，但是要求ncRNA与蛋白质牢固结合，共纯化蛋白要有高度特异性抗体；鸟枪克隆法，也称为RNA组学，能够检测特定条件下所有的ncRNA，而不需预先知道ncRNA的特征，但费用昂贵，工作量繁重；基因芯片技术可用于研究ncRNA的表达和寻找新的ncRNA转录本，但费用昂贵，通常ncRNAs检测结果与Northern杂交信号不一致；生物信息学方法可以预测新的ncRNAs，能够迅速得到许多可能的ncRNAs候选基因列表，但其需要预先知道ncRNAs的特征和对许多候选位点进行验证；基因组SELEX具有靶分子范围广，筛选出的配体亲和力和特异性高等特点，对基因组序列无要求，能够发现与特异蛋白质结合的ncRNA，可直接鉴定它们相互作用；转录组直接测序可得到特定条件下所有RNA转录本的丰度信息，能从整体水平研究基因结构和功能，采用此技术对ncRNA的高通量、高效率的筛选和鉴定，现已成为ncRNA研究的主要手段［16-18］。

2 牦牛非编码RNA的研究进展

进入21世纪以来，随着基因组学研究的不断深入，非编码RNA的研究越来越引起人们的关注，对于具有调控作用的RNA分子，其种类非常丰富，是许多生命过程中富有活力的参与者，成千上万的ncRNA组成了巨大的分子网络，调节着细胞中的生命活动，几乎涉及所有的生命活动过程，如在细胞的增殖、分化与死亡，发育调控，理化代谢调节、转座子沉默、环境应激和免疫调控等。《自然》杂志多年来专门开辟了一个专题，聚焦非编码RNA，主要针对它的有关研究进展、新思路、新方法和新技术等进行系统全面的解析。

目前，模式动物ncRNA的研究已较为广泛深入，涉及动物的生理、病理、生化、免疫、营养和环境等众多方面，主要表现在：参与动物的生长发育、繁殖调控、营养代谢、环境应激和免疫应答等的分子调节，并发挥着重要的调控作用。其中，尤其是两类微小RNA（miRNA和piRNA）对动物生殖发育的调控研究，已经成为当今的热点之一。许多研究表明，这两类微小RNA在动物精子发生和雄性不育方面，具有极其重要的调控作用，在早期可调控精原干细胞的增殖和分化，而后期可通过转录抑制细胞周期转录因子而使生精细胞的凋亡减少，促进正常精子的形成等［19-21］。而就牦牛非编码RNA而言，与其他动物相比较相对较为滞后，但是随着高通量测序技术及其配套生物信息学平台的不断发展、完善与广泛使用，并随着普通牛与牦牛全基因组序列的相继公布［22］，以及千牛基因组计划的兴起与实施［23］，从而较大地促进了牦牛ncRNA的研究，至今已取得了一定的成果，主要集中在miRNA这类微小RNA上，涉及参与牦牛的泌乳、生长和繁殖等的分子调控。

现阶段，虽然有关模式动物ncRNA的研究已取得了较大进展，但是牦牛ncRNA的研究还处于起步阶段，仅集中在miRNA上，被发掘的功能miRNAs还不多。除了白文林等［24］于2013年在奶牛科学杂志《The Journal of DairyScience》上发表了利用定量PCR技术对泌乳体细胞中4个miRNAs（miR16b、miR21-5p、miR145和miR155）进行差异表达检测外，牦牛ncRNA的研究近年来主要来自西南民族大学牦牛创新团队。该团队相关成员利用高通量的Solexa测序技术，测定了犏牛基因组，以及牦牛、犏牛、普通牛睾丸和卵巢的转录组和miRNAs，结合已公布的牦牛和普通牛的全基因组序列，通过生物信息学分析和文本挖掘，得到了许多可能与生殖相关的候选基因和miRNAs，并检测了它们的表达差异［25-26］。其中，犏牛和牦牛睾丸组织中miRNAs总共946个，已知miRNAs为466个，而新预测出的候选miRNAs为480个，通过对部分miRNAs的定量PCR验证，结果显示，犏牛睾丸中有8个miRNAs表达上调，2个miRNAs表达下调，它们可能在犏牛睾丸的精子发生中起到调控作用。

牦牛是青藏高原特有的牛种，数量仅次于黄牛、水牛，而居第三位，占我国牛只总数的1/6，从古至今都是青藏高原牧区的优势种家畜和当家畜种。牦牛遗传资源具有不同于其他畜种资源的特点，大多分布在青藏高原300万km2的人口稀少地区，主要为西部多个少数民族居住地，牦牛业作为典型的节粮型畜牧业和季节性畜牧业的最佳畜种之一，对加强民族团结、稳定边疆具有重要意义［27］。牦牛是一个“全能”的畜种，具有深度开发价值，可为人类提供肉、乳、毛、绒、役力等用途广泛的产品。其中，通过杂交改良可以丰富和扩大牦牛品种的遗传基础，提高生活力和生产性能，许多研究结果表明，牦牛品种间、家野牦牛间、牦牛同普通牛间杂交均可获得程度不同的杂种优势，可显著地提高乳、肉等生产性能，尤其是牦牛同普通牛间的杂交，杂种一代犏牛表现出很强的杂种优势：生长发育快、早熟，适应范围扩大，世代间隔缩短，产乳量、产肉量可比牦牛高1倍以上，但是F1犏牛雄性不育，限制了杂种优势的利用和新品种的培育［28］。因此，对这些miRNAs有哪些特性？新的调控miRNAs和尚未研究的piRNAs有多少？它们中具有重要调控功能的miRNAs和piRNAs在牦牛、犏牛和普通牛不同生长时期睾丸不同生殖细胞类群中是否特异性表达或共表达？它们的靶基因是哪些？它们如何通过这些特异靶基因来调控3种牛雄性生殖细胞——精原干细胞的自我更新与增殖？阐明这些分子机理，将有助于科学诠释犏牛雄性不育的分子机理，可为犏牛杂种优势的利用和牦牛遗传育种提供科学依据。与此同时，加快牦牛和犏牛ncRNA的筛选与鉴定，尤其是miRNAs和piRNAs及其作用靶标筛选与鉴定，并研究它们和靶标间的相互作用，不断挖掘出它们的生物学功能，最终探明其在生理、病理、生化和免疫等中的分子调控机理，对于促进牦牛和犏牛的生长发育、繁殖调控、环境应激和免疫应答等研究具有重要的现实意义和广泛的应用前景。

3 非编码RNA在遗传学中的教学应用

遗传学是自然科学领域中探究生物遗传和变异规律的科学，作为高等院校生命科学及农林牧渔等相关专业教学中一门重要的基础和核心学科之一，发展极为迅速，内容众多，知识体系构成丰富多样。随着生命科学迅速发展，尤其是随着与遗传学发展密切相关的生物化学与生物物理等领域中的新技术不断涌现，多学科交叉融合，互为依托，协同发展，正在给生命科学领域带来一场深刻的变革，极大地彰显了遗传学旺盛的生命力和巨大的发展潜力。目前，在高校遗传学教学过程中，遗传学教学必须跟上学科的发展，需要不断增添反映学科进展的内容，这就要求教师与时俱进，根据教学需要不断扩充知识，充分利用现代化的教学手段，通过追踪热点问题激发学生的探索欲望，通过融入科技前沿培养学生的创新思维，因材施教，引导学生积极参与教师的科研项目，培养学生的实践能力，从而培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力，提高学生的科研素质。

对于高等教育而言，其教学的目标和任务是培养具有创新精神和实践能力全面发展的高级专门人才，而ncRNA作为非编码基因组学重要的研究内容之一，可为生命科学及相关本科专业大学生的科学思维训练和创新能力培养提供了良好的素材。非编码基因组学的发展不仅仅是遗传学新研究领域的开拓，同时也是遗传学乃至生命科学在研究思想的一次革新，通过引入这些新进展、新方法、新技术和新思维，往往能激发学生的兴趣和求知欲，从而提高遗传学教学效果。目前，国内已有很多遗传学教材都设置了基因组学章节，如赵寿元等编著的《现代遗传学》（第2版）、戴灼华等编著的《遗传学》（第2版）、陈竺等编著的《医学遗传学》（第2版）和刘祖洞等编著的《遗传学》（第3版）等，但这些教材中基因组学和非编码基因组学部分篇幅相对偏少，内容较为简单。但随着遗传学教学界对基因组学尤其是非编码基因组学的越来越重视，国内遗传学教材必将会加大基因组学和非编码基因组学的篇幅。

兴趣是最好的老师，可激发学生内心的求知欲望，调动学生学习的主观能动性，主动学习、认真思考、勇于探索。因而，如何在教学过程中引入学生感兴趣的热点问题，紧跟科技和科研发展的脚步，选择合适的教学内容，有效地组织课堂教学，让学生感受到教师教授的内容不仅仅是书本上一成不变的专业知识，进而促使学生能积极主动去学习和认识未知的世界。例如，在讲解基因到蛋白质之间遗传信息的传递规律——中心法则时，可引入ncRNA的教学内容，通过讲解ncRNA的概况与进展，使学生知道中心法则并非是一成不变的规律，它需要不断的修改、补充和完善，使学生认识到写在教科书里的知识也在不断更新，并结合实际例子，如微小RNA在畜禽生殖发育中的调控功能等的介绍与分析，激发学生兴趣，从而促进学生更好地掌握所学知识、更好地推动学生相关能力的培养。

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Research Progress on Non-coding RNA of Yak and Preliminary Study on Teaching the Course of Genetics

Ou Jiangtao，LiangHuixing，ZhaoWeihong，et al
（School ofMarine and Bioengneering，YanchengInstitute ofTechnology，Yancheng224051，China）

Non-condingRNA（ncRNA）plays an important role in the cellular activities，although these non-codingRNAs donot express the proteins，theyplaykeyroles in the regulation of target gene expression at transcription，post-transcription and translation levels，involved in eukaryotic growth and development，cell proliferation and differentiation，metabolism，cell signalling and immune response，and have been the hot frontier of life sciences in recent years.The research progress in ncRNA ofyak and the utilization of genetics teaching were reviewed in this paper，so as to provide

for yak genetics-breeding and genetics teaching.

yak;non-codingRNA;genetics and breeding;genetics teaching

S823.8+5

A

2095-3887（2015）06-0052-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.06.017

2015-10-28

国家自然科学基金项目(31000072、31570176)；国家科技支撑计划子课题项目（2012BAD13B02）；盐城工学院教育教改研究项目（JY2015A13）；江苏省海洋滩涂生物化学与生物技术重点建设实验室资助

欧江涛(1975-)，男，讲师，博士，主要从事畜禽动物生物技术和滩涂生物药食生物技术的研究与应用开发工作。