细胞培养技术在中药炮制研究中的应用

[摘要] 随着细胞培养技术的不断进步和完善，其应用领域也在不断的扩大。近年来，细胞培养技术在中药炮制研究中已得到广泛应用，如不同炮制品之间的药效作用比较、炮制减毒作用的研究及炮制原理的分子机制探讨等。本文就细胞培养技术在中药炮制研究中的应用进行综述，并对目前研究中出现的问题进行分析，为细胞培养技术在中药炮制研究中的深入应用提供参考。

[文献标识码] A

[文章编号] 1674-926X(2015)05-018-04

[作者单位] 成都中医药大学，四川 成都 611137

[作者简介] 李江维，女，2014级药剂学硕士研究生，主要研究方向为中药炮制新工艺及炮制原理研究

[通讯作者] 许润春，女，博士，副教授，硕士生导师，主要研究方向为中药炮制新工艺及炮制原理研究Email:309786953@qq.com

[收稿日期] 2014-12-16

Application of cell culture in the study of process of traditional Chinese Medicine Study

/LI Jiang-wei, XU Run-chun,

WANG Peng-fei //( Chengdu university of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

[Abstract] The application fields are expanding with the constant progress of cell culture technology. In recent years, cell culture technology has been widely used in the study of processing of Traditional Chinese Medicine. For example, it can be used in the comparison of effects among different processed products, toxicity attenuation research after processing, and investigation of molecular mechanism of processing theory and so on. The application of cell culture in the study of processing is reviewed and the problems in the present study are analyzed in this paper to provide reference for the further application of cell culture in the study of processing.

[Key words] Cell culture; processing of traditional Chinese Medicine; the role of processing; the theory of processing

动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法 [1]。细胞培养技术具有简便、准确、快捷等特点，在药物研究领域主要用于检测各种药物对细胞生长的影响，通过培养细胞的生长曲线计数细胞增长的绝对指数，直观地了解细胞生长与死亡的动态变化，从而反应出药物的作用。中药在临床应用前，都需经过炮制制成炮制品方能入药。通过细胞培养技术可研究比较不同炮制品的药效作用、毒性的变化及药物的分子作用机制和炮制原理，并且可通过研究所得结果初步筛选出中药炮制的最佳工艺条件。本文就细胞培养技术在中药炮制现代研究中的应用作一综述。

1　细胞培养技术在炮制作用研究中的应用

中药在临床应用前，需通过炮制加工成一定规格和质量要求的饮片，中药的不同炮制品，其药性、用法、作用等均有所不同。通过细胞培养可在较短的时间内比较得出中药不同炮制品的作用，大幅提高研究效率。

徐刚等 [2]采用CCK-8法筛选出酒狗脊为最佳炮制品，其促成骨细胞增殖作用最强。陆跃鸣等 [3]采用体外培养肿瘤细胞的方法，直接观察生半夏、姜浸半夏、姜煮半夏、矾半夏、姜矾半夏五种半夏炮制品中总生物碱对肿瘤细胞生长抑制作用及形态损伤作用，结果显示姜浸半夏在低浓度时作用就较明显，而在高浓度时矾半夏作用最明显。吴皓等 [4]还研究半夏及其姜制抗肿瘤细胞生长作用，结果表明，姜浸半夏、矾半夏、姜矾半夏对细胞的损伤作用均较明显，而姜浸半夏作用最强。对细胞增殖抑制作用，仍以姜浸半夏最佳。此外，周信等 [5]研究表明生半夏、清半夏、姜半夏、法半夏之间作用强度存在差异，生半夏对小鼠主动脉内皮细胞炎性因子分泌抑制作用强于炮制品。陆平成等 [6]表明高压炮制的藤黄对骨髓瘤细胞的杀伤作用最强，而对艾氏腹水瘤细胞则高压制、荷叶、山羊血和水制的藤黄效果较好。对正常的腹腔巨噬细胞而言，则豆腐炮制的藤黄毒性最强。结果还提示炮制时所用的各种辅料对藤黄的细胞毒作用影响不大，影响其细胞毒作用的主要是炮制的温度和时间。王耿等 [7]研究藤黄及其炮制品对K562肿瘤细胞生长抑制作用，结果表明生藤黄、清水煮藤黄、高压蒸制藤黄、豆腐制藤黄、荷叶制藤黄、山羊血制藤黄对K562肿瘤细胞的生长均有抑制作用，其中高压蒸制藤黄的抑制作用最强。易春霞等 [8]研究何首乌不同炮制品对H 2O 2致PC12细胞损伤的保护作用，与何首乌生品相比较，清蒸和黑豆汁蒸均可加强何首乌保护PC12细胞免受H 2O 2损伤的作用。王敏江等 [9]研究何首乌不同炮制品对肝细胞脂代谢的干预作用，结果表明生何首乌及何首乌传统炮制品、发酵炮制品均有显著地降脂作用，其中米根霉发酵得到的发酵品的降脂活性较好，并提示发酵法可能成为何首乌炮制法研究的新方向。焦艳等 [10]研究比较麦冬酒制前后对内皮细胞的缺氧保护作用，结果表明麦冬酒制后更能显著拮抗缺氧对人脐静脉内皮细胞的损伤。李佳川等 [11]运用生物效应法从细胞途径研究不同黄连炮制品“止消渴”药效，结果表明黄连生品、萸制黄连、酒炙黄连、酒蒸黄连、姜制黄连、醋制黄连六种黄连炮制品均能明显或部分降低培养液中的葡萄糖含量，提高脂肪细胞对葡萄糖的利用率，同时在一定剂量范围可明显促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖。在对3T3-L1前脂肪细胞诱导分化的影响上，各炮制品在一定剂量下抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。其综合作用与生品比较，萸制黄连、酒蒸黄莲、酒炙黄连均较明显。潘新等 [12]研究复方二神丸中补骨脂、肉豆蔻炮制后对T淋巴细胞亚群cAMP/cGMP的调节作用，结果表明补骨脂盐炙、肉豆蔻煨炙后入药组大鼠比补骨脂、肉豆蔻生品入药组的恢复效果好，补骨脂和肉豆蔻在炮制后对模型大鼠的CD 3+CD 4+，CD 3+CD 8+，cAMP/cGMP调节作用增强。并提示其增强脾肾阳虚泄泻大鼠的止泻作用可能与调节模型大鼠的T细胞亚群和cAMP/cGMP水平的平衡有关。郭重仪等 [13]研究不同炮制方法的巴戟天对小鼠抗氧化及细胞免疫功能的影响，结果表明生晒及盐制巴戟天均可提高淋巴细胞转化率及NK细胞杀伤功能，从而增强细胞免疫，其生晒品比盐制品作用效果好。徐勇等 [14]研究炒麦芽含药血清对MMQ大鼠垂体瘤细胞增殖影响，结果表明中、高剂量组炒麦芽含药血清对瘤细胞的增殖有抑制作用，并随培养时间延长抑制作用慢慢减弱，而低剂量炒麦芽在48h前随培养时间延长可促进瘤细胞增殖，48 h后这种作用发生翻转。表明炒麦芽对垂体泌乳素腺瘤增殖具有双重作用。李召等 [15]研究比较不同加工工艺鹿茸组分对慢性再生障碍性贫血患者骨髓造血细胞体外增殖的影响，结果表明冷工艺鹿茸对再障骨髓细胞的增殖作用明显且优于热榨茸。卓丽红 [16]等研究制何首乌对大鼠造血祖细胞增殖及骨髓细胞黏附分子表达的影响，结果表明首乌经过蒸制后能明显促进粒系造血祖细胞的增殖，并且能够明显降低骨髓抑制大鼠骨髓单个核细胞黏附分子CD54的表达。赵凤鸣等 [17]研究山茱萸生、制品二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰人胚肺细胞影响，结果表明生山茱萸、酒制山茱萸水煎液去多糖二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰人胚肺细胞具有一定保护作用，但二者之间无显著差异。赵青春等 [18]研究发现生山茱萸及酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位对D-半乳糖致衰小鼠骨髓细胞表现出一定的保护作用，且酒制山茱萸二氯甲烷萃取部位保护作用更明显。

由上可知，细胞培养技术可以用于中药不同炮制品之间作用的比较，可在较短时间内筛选出治疗作用更佳的炮制品，分析出中药炮制过程中影响药物作用的因素，为中药炮制方法、工艺、辅料的研究和优化提供理论基础。

2　细胞培养技术在炮制减毒研究中的应用

沈炜等 [19]研究雷公藤不同炮制品对人胚肝细胞L-O2增殖的影响，结果表明酒蒸、煅炭、醋蒸、羊血炖等方法炮制后的雷公藤对人胚肝细胞的毒性比饮片更小，并提示雷公藤可通过这4种炮制方法来降低肝脏毒性。刘伟杰等 [20]采用体外培养Lewis细胞，研究斑蝥酒制品对小鼠肺癌的影响，结果表明斑蝥经酒浸泡后可在保持抗肿瘤活性基础上降低其毒性。张丽等 [21]研究不同方法炮制甘遂对LO2细胞周期与凋亡的影响，结果表明甘遂炮制后可降低其对LO2细胞的毒性，而且甘遂醋制工艺中的炒与醋润2种操作在醋制降低甘遂的肝毒性中能够起到协同作用。曹雨诞等 [22]研究醋制京大戟对小肠隐窝上皮细胞的毒性，结果表明醋制可降低京大戟对肠细胞的毒性。李福全等 [23]研究蒙药诃子汤制草乌总生物碱对乳大鼠心肌细胞的毒性作用，结果表明诃子汤炮制的草乌总生物碱对心肌细胞的毒性作用明显低于生草乌总生物碱，由此提示采用诃子汤炮制能降低草乌的心肌毒性。

由上述可知，运用细胞培养技术可在短时间内分析出不同炮制品细胞毒性作用的大小，并可根据研究结果筛选出减毒的最佳炮制方法，同时提示新的炮制减毒方法。

3　细胞培养技术在炮制原理研究中的应用

冯丽敏等 [24]研究醋柴胡水提液对人胚肾细胞HEK293中MRP1影响的作用机制，结果表明醋柴胡能增加胞内MRP1转运底物秋水仙碱的外排，但可能并非通过改变MRP1 mRNA和蛋白表达水平而实现。赵瑞芝等 [25]对醋柴胡小分子水溶性部位抑制HEK293-Pgp细胞中P糖蛋白的外排功能进行研究，初步探索得出醋柴胡小分子水溶性部位对P糖蛋白抑制作用具有选择性，醋柴胡小分子水溶性部位有可能实现增强抗癌药疗效的作用，且作用位点可能在基因水平，提示醋柴胡引经作用的位点可能在基因水平。陈海鹰等 [26]研究醋制降低京大戟对人正常肝细胞LO2的毒性机制。结果表明其减毒机制可能是减轻细胞氧化损伤，从而降低细胞周期阻滞，减少细胞凋亡，为进一步阐明京大戟醋制减毒的机制提供了依据。颜晓静等 [27]采用体外培养脾淋巴细胞、腹腔巨噬细胞，初步探讨甘遂醋炙减毒机制。研究结果提示在甘遂醋炙过程中加热和醋润两个炮制程序能够起到降低甘遂致炎毒性的协同作用，为探讨甘遂醋炙减毒机制提供了一定的依据。唐丹霞等 [28]研究厚朴汁炙远志含药血清对胃Cajal 间质细胞活力及nNOS表达的影响，结果表明厚朴汁炙远志炮制品缓解胃动力障碍的分子生物学机制，可能与下调胃Cajal 间质细胞胞内nNOS，促进胃Cajal 间质细胞活力有关。吴有莲等 [29]研究了制何首乌对成骨细胞的作用机理，结果表明其作用机理可能与上调成骨细胞成骨相关基因的表达有关。李淑雯等 [30]研究香附醋制前后对Caco-2细胞P-糖蛋白功能和表达的影响，结果显示香附醋制后对P-糖蛋白的功能和表达呈现出抑制作用，由此说明柴胡醋制增效的机理可能是抑制P-糖蛋白对药物的外排，从而增加药物浓度，提高药效。余小华等 [31]研究炒麦芽含药血清对MMQ大鼠垂体瘤细胞NGF、PRL分泌表达的影响，结果显示低剂量炒麦芽和中剂量炒麦芽均可以促进NGF少量分泌，此时NGF与受体trkA结合而使垂体瘤细胞PRL激素的分泌增加，而大剂量炒麦芽含药血清干预垂体瘤细胞时NGF分泌量较大，NGF则与P75受体结合，从而启动诱导垂体瘤细胞凋亡过程，进而抑制PRL激素的分泌。由此说明炒麦芽可能是通过上调NGF的分泌进而抑制PRL激素的分泌。唐丹霞等 [32]研究厚朴汁炙远志对小鼠胃Cajal 间质细胞Ca 2+通道的影响，结果显示厚朴汁炙远志炮制品能明显缓解远志对正常小鼠胃Cajal 细胞Ca 2+通道损伤，维持细胞钙稳态，提高细胞活力，其机制可能是升高细胞外液Ca 2+量、减弱对ATP酶活力的影响及降低胃间质细胞内1，4，5-三磷酸肌醇水平，起到缓解因远志导致胃肠动力紊乱所致的胃动力障碍。

4　细胞培养技术在中药炮制研究其他方面的应用

细胞培养技术在中药炮制品作用研究中的应用除上述三个方面，也应用在炮制品有效成分或有效提取部位的筛选。于海涛等 [33]对狗脊炮制品中促进成骨细胞增殖分化的成分进行了筛选。鞠成国等 [34]研究狗脊生、制品不同提取部位对成骨细胞的影响，结果表明狗脊正丁醇提取部位对细胞增殖作用最明显。通过对炮制品有效成分和有效提取部位的研究，也可为研究中药炮制的新方法提供参考依据。此外，王万根等 [35]研究何首乌高压蒸制法蒸制时间对何首乌抗衰老活性影响，在压力为150 kPa，温度为121℃的条件下分别加压炮制1 h、2 h、3 h、4 h，最后筛选出高压蒸制法炮制何首乌的最佳炮制时间为3 h。

5　结论与讨论

与动物整体作为研究对象比较，细胞培养技术具有准确控制药物作用对象、时间、剂量以及细胞生长条件的优点，可直接观察药物对细胞形态结构和生命活动的影响，在大型动物作为研究对象时，还具有耗资少的优点。此外该技术还具有实验周期短、操作简单、结果可靠等特点。

综上所述，细胞培养技术在中药炮制增效、减毒以及炮制原理研究等方面已得到广泛的应用，在炮制工艺研究方面也有报道，为中药炮制的现代化研究注入了新的生机。目前细胞大多是在一种有限的二维的生长空间内培养，在此条件下虽然可使细胞维持生长、繁殖，但相对于机体这个系统来讲，仍存在很大的差异，所以由此研究所得结果不能等同于在体内研究的结果。随着细胞培养技术的不断进步和完善，细胞培养体系已从二维发展到三维，三维细胞培养技术中细胞生长的生理微环境与机体内细胞生长的生理微环境更加相近，研究结果更加接近体内研究结果，因此更具参考价值。可运用三维细胞培养技术研究炮制对中药药效的影响，以避免实验疗效显著而临床效果下降的现象，筛选出治疗效果显著的炮制品和更加优异炮制条件及可靠的炮制方法，从而指导优化炮制条件，指示新的炮制方法。也可用于研究细胞之间、细胞与细胞外基质的相互作用对药物作用的影响，进一步阐明药物作用机制，为研究炮制增效减毒等传统的炮制理论奠定基础。