奶水牛子宫内膜炎病原菌鉴定与药敏试验

方丽婷 李俊 吴伟虎（广西-东盟经济技术开发区（南宁华侨投资区）动物卫生监督所 530105）

奶水牛子宫内膜炎病原菌鉴定与药敏试验

方丽婷 李俊 吴伟虎（广西-东盟经济技术开发区（南宁华侨投资区）动物卫生监督所 530105）

通过对南宁的某奶水牛场中的12头患子宫内膜炎奶水牛进行子宫采样和调查，并在无菌条件下，对采集的样本进行了病原菌的分离鉴定和药物敏感性试验。分离纯化培养得到38种细菌，没有发现真菌。药物敏感性试验结果表明，葡萄球菌对红霉素、克林霉素、米诺环素、诺氟沙星、头孢吡肟高度敏感，对复方新诺明、氨曲南等产生了不同程度的耐药性；奈瑟氏菌对克拉霉素、头孢吡肟高度敏感，对复方新诺明、氨曲南产生了不同程度的耐药性；非发酵菌和肠杆菌科对头孢他啶、头孢曲松、氨曲南等有较高的敏感性，对氨苄西林、哌啦西林、氧氟沙星、链霉素等产生了不同程度的耐药性。

奶水牛；子宫内膜炎；病原菌；分离鉴定；药敏试验

1 试验目的

由于近年来，人们不合理地使用抗生素类药物，导致具有耐药性菌株越来越多，药物残留也越来越严重，造成不同地区和不同环境引起子宫内膜炎的致病菌都有所不同，使得奶水牛子宫内膜炎的治疗难度越来越大，要求也越来越高。而且奶水牛子宫内膜炎的发病依然比较高，给奶水牛养殖业带来相当严重的经济损失。

因此，本试验通过对南宁某奶水牛场中的患子宫内膜炎奶水牛进行了子宫采样和调查，并在无菌条件下，对采集的样本进行了病原菌的分离鉴定，并进行药物敏感性试验，耐药性分析。为了更好地了解当地的子宫内膜炎的病原菌的细菌种群，筛选出抑菌效果明显的药物，为临床治疗奶水牛子宫内膜炎及用药提供理论依据。

2 试验材料

2.1 试验样品来源

本试验样品是按照临床型奶水牛子宫内膜炎的诊断标准选取南宁附近某牛场的12头患病奶水牛。清洗病牛阴部，用直肠检查的方法用手握住子宫颈，使子宫内黏液流出阴道。弃去最初流出黏液，用已经消毒好的青霉素瓶收集中间或最后流出的黏液，密封，做好标记，迅速带回实验室做细菌的培养分离鉴定[1]。

2.2 主要培养基及制备

2.2.1 营养肉汤（北京陆桥）

准确称取成品李氏菌增菌肉汤2.2g，放入烧杯中，加入100ml蒸馏水，加热溶解，分装试管5ml每管，高压灭菌l5min，待冷却后4℃保存备用。

2.2.2 营养琼脂02.2.5（北京奥博星）

准确称取成品营养琼脂3.3g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热煮沸至溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃时倒制成平板，待凝固，4℃保存备用。

2.2.3 Fungi Medium真菌培养基CM802（北京陆桥）

准确称取成品Fungi Medium真菌培养基2.85g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃时倒制成平板，待凝固后4℃保存备用。

2.2.4 MH血琼脂基础CM177（北京陆桥）

准确称取成品MH血琼脂基础3.8g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷至50℃，每瓶加入10ml新鲜无菌家兔血，倒制成平板，制成9%血液琼脂培养基，待凝固，4℃保存备用。

2.2.5 麦康凯琼脂CM908（北京陆桥）

准确称取成品麦康凯琼脂5.5g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃时倒制成平板，待凝固后4℃保存备用。

2.2.6 SS琼脂HB4089（青岛海博）

准确称取成品SS琼脂6.35g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃时倒制成平板，待凝固后4℃保存备用。

2.2.7 伊红美蓝琼脂（EMB）02.0.2（北京奥博星）

准确取成品伊红美蓝琼脂4.25g，放入250ml容量瓶中，加100ml蒸馏水，加热溶解，121℃高压灭菌15min，冷却至50℃时倒制成平板，待凝固后，4℃保存备用。

3 试验方法

3.1 细菌的培养分离及纯化

按照无菌操作，取出样品，摇匀后用移液器吸取100μl注入普通琼脂培养基内，再用推棒来回推动，使之在普通琼脂培养基内分布均匀。待稍干后倒置放入电热恒温培养箱中培养18～24h，取出观察并记录菌落生长情况。如果细菌太多无法分离时，进行倍比稀释后再涂布平板分离。对生长的可疑菌落，结合菌落特征、涂片染色镜检特征，标记菌株号，并挑取单个菌落进行纯化，再涂片，染色镜检。若镜检无杂菌，再接种于肉汤中，置于37℃恒温箱培养18～24h，观察细菌在肉汤中的生长情况，并进行涂片、染色、镜检，做好试验记录和标记，作为鉴定菌种，同时保存备份菌种，低温冷藏于冰箱[2]。

3.2 细菌的形态观察

对各细菌菌落的生长情况和形态结构特征进行观察记录，并将纯化的细菌进行革兰氏染色、镜检，镜检后对尚未纯化的细菌从新分离培养及纯化。

3.3 细菌的生化鉴定

参照《兽医微生物实验指导》[3]《伯杰细菌鉴定手册》[4]和《常见细菌系统鉴定手册》[5]中的细菌分群方法，并根据菌落形态特征、革兰氏染色特征及镜检形态等将各分离纯化的细菌进行初步确定细菌类属，确定其生化反应和其他鉴定项目。并将其分别接种于营养琼脂平板，37℃培养18～24h后供生化试验用。

3.4 药敏试验

参照中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布的《动物及其制品中细菌耐药性的测定-纸片扩散法》中的标准，选择药物进行药物敏感性试验。

4 试验结果

4.1 细菌分离纯化培养结果

从试验样品中分离纯化培养共得到38株菌株，没有发现真菌。将经过纯化的38株细菌根据形态、生长特征和生化特性鉴定，分别为：1、12、13、15、16号菌株是表皮葡萄球菌；8、11、18、23、27、37号菌株是木糖葡萄球菌；4、5、10、22、38号菌株是溶血葡萄球菌；35号菌株是腐生葡萄球菌；14号菌株是金黄色葡萄球菌；20、28号菌株是微球菌；17号菌株是黏液奈瑟氏菌；19号菌株是卡他布兰汉氏菌；36号菌株是金黄奈瑟氏菌；6、29、30、32号菌株是恶臭假单胞菌；24号菌株是类产碱假单胞菌；31、34号菌株是醋酸钙不动杆菌；2、7、9、33号菌株是黄杆菌（ⅡB群）；21号菌株是缺陷假单胞菌；3号菌株是施氏假单胞菌和25、26号菌株是大肠埃希氏菌。

4.2 药敏试验结果

从《动物及其制品中细菌耐药性的测定-纸片扩散法》中选定药物对12份试验样品中分离鉴定出来的16种细菌进行药敏试验，药物敏感性参照美国临床和实验室标准研究所（CLSI）《抗生素敏感性试验纸片扩散法操作标准》。

药物敏感性试验结果表明，葡萄球菌对红霉素、克林霉素、米诺环素、诺氟沙星、头孢吡肟高度敏感，对复方新诺明、氨曲南等产生了不同程度的耐药性；奈瑟氏菌对克拉霉素、头孢吡肟高度敏感，对复方新诺明、氨曲南产生了不同程度的耐药性；非发酵菌和肠杆菌科对头孢他啶、头孢曲松、氨曲南等有较高的敏感性，对氨苄西林、哌啦西林、氧氟沙星、链霉素等产生了不同程度的耐药性。

5 讨论与小结

从分离培养中发现，该奶水牛场患病奶水牛大部分是混合感染，大多数都是由2种或者2种以上的病原菌引起的。这可能与该牛场的饲养环境和饲养管理条件有关。所以在临床抗菌药物的使用中，应考虑停用对细菌不敏感的药物，治疗中建议采取联合用药方法，不能随意加大剂量，避免耐药性产生，从而取得最佳疗效。

药敏试验结果表明，红霉素、克林霉素、米诺环素、诺氟沙星、头孢吡肟等药物对葡萄球菌属的菌株敏感或高度敏感；克拉霉素、头孢吡肟等药物对奈瑟氏菌属菌株敏感或高度敏感；头孢他啶、头孢曲松、氨曲南等药物对非发酵菌属和肠杆菌科的菌株敏感。以上的药物可作为奶牛子宫内膜炎的首选药物。

本试验受设备的限制，没有进行厌氧菌和真菌的分离培养，但是不能排除尚有厌氧菌和真菌感染的可能。本试验从患病奶水牛分离到了多种细菌，但这并不一定意味着它们都是子宫内膜炎的直接致病因子。它们中多数为环境中常见菌，有些可能只是继发性感染。至于具体哪种或哪几种细菌是子宫内膜炎的直接致病菌，有待进一步研究。

[1]Azawi OI.Postpartum uterine infection in cattle[J].Animal Reproduction Science,2008,105（3）：187-208.

[2]覃庆玉,毕芳芳,张朝胜,杨照海,何宝祥,等.南宁市郊奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定[J].广西畜牧兽医,2009,25（2）：74-75.

[3]姚火春.兽医微生物实验指导（第二版）[M].中国农业出版社,2002,1.

[4][美]R.E.布坎南,N.E.吉本斯,等.伯杰细菌鉴定手册（第八版）[M].科学出版社,1984.

[5]东秀珠,蔡妙英,等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社,2001,2.