PDE4D基因SNP83多态性与缺血性卒中预后的相关性研究

宋彦丽，王春娟，王蓬莲，林金嬉，马越涛，刘丽，杜万良，刘改芬

卒中的疾病负担巨大，而且越来越多的研究证明卒中具有明显的遗传倾向[1-2]。2003年冰岛科学家Gretarsdottir首次证实了磷酸二酯酶4D（phosphodiesterase 4D，PDE4D）基因多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与缺血性卒中相关[3]。此后该基因成为国际学者研究的热点，其基因多态性与不同地区、不同种族人群缺血性卒中的关系存在很大的争议，多数研究主要关注PDE4D与卒中发病的关系，而PDE4D与卒中预后相关性的研究较少[4-7]。PDE4D基因SNP83（rs966221）位点有A、G两个等位基因，其中A等位基因是中国人群中的野生型。本研究采用Sequenom Massyarray检测技术检测该位点的基因型情况，探讨该位点与缺血性卒中预后的相关性。

1 对象和方法

1.1 研究对象 本研究连续入选2009年10月～2011年7月北京天坛神经内科住院的缺血性卒中患者736例。所有参与者都签署知情同意书。本研究得到首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会的批准。

1.2 入选标准 ①临床诊断明确的新发急性缺血性卒中患者；②年龄＞18岁；③发病距就诊日期在14 d内；④完成颅脑磁共振弥散加权成像成像（diffusion weighted imaging，DWI）检查；⑤入院后24 h内留取血样，提取患者白细胞脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）；⑥签署参与研究的知情同意书。

1.3 排除标准 ①无症状和体征的静息性缺血性卒中；②非缺血性卒中的其他脑血管事件如短暂性脑缺血发作（transient ischemic stroke，TIA）、脑出血或蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）等；③经证实的非脑血管事件；④脑血管事件发生至就诊时间超过14 d；⑤未完成DWI检查；⑥24 h内未留取血样的患者；⑦拒绝签署研究知情同意书。

1.4 临床资料收集 ①该研究为单中心研究，依据入排标准连续入组发病14 d内的急性缺血性卒中患者。每例患者均通过电子病历报告表（electronic Case-Report Form，eCRF）记录患者的临床信息，包括人口学信息、既往史、现病史、用药史、家族史、体格检查、美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分、改良Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）评分等相关资料；通过检验系统数据平台（Lis系统）收集患者的化验信息（包括血脂、血糖、血常规、超敏C反应蛋白、抗心磷脂抗体、红细胞沉降率、同型半胱氨酸、免疫相关指标等）；通过影像数据平台（PACS系统）收集患者影像检查信息，包括计算机断层扫描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、颈部血管超声、经颅多普勒超声（transcranial Doppler，TCD）、数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、12导联心电图、24 h动态心电图、经胸超声心动图等。②随访：每例患者均由北京天坛医院随访中心经过统一培训的随访人员在卒中发病后3个月进行电话随访，随访内容包括mRS评分（以1分为界分为预后良好和预后不良[8]）、死亡、卒中复发、其他血管事件、用药情况等。本研究的联合终点事件定义为卒中复发、TIA复发、死亡以及其他血管事件。

1.5 基因多态性检测 该研究使用Sequenom平台自带的引物设计软件Assay Design进行引物设计，采用Sequenom Massyarray技术进行PDE4D基因SNP83（rs966221）位点基因多态性的检测。

1.6 统计学方法 对计量资料进行正态性检验，对于符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示其平均水平，不符合正态分布则用中位数（四分位数间距）来表示其平均水平；计数资料用频数和构成比来表示。计量资料如果符合正态分布，两组间差异比较采用t检验，如不符合正态分布，采用秩和检验；计数资料比较用卡方检验。采用卡方检验分析SNP位点基因频率分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，P≥0.01认为样本来自遗传平衡的群体，具有较好的代表性。采用Logistic回归模型分析不同遗传模型下SNP83基因多态性与卒中后联合终点事件发生（复发、死亡等联合终点事件）和预后不良（mRS＞1分）的关联，并计算比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI）。所有统计学分析用SAS 9.3软件（SAS Institute Inc，Cary，North Carolina）进行分析，P＜0.05表示差异有显著性。

2 结果

2.1 临床特点 该研究按照纳入和排除标准共纳入736例缺血性卒中患者，3个月随访时59例患者失访，失访率为8.02%，剩余677例患者的临床信息见表1。与未发生联合终点事件的患者相比，发生联合终点事件的患者年龄较大［（67.02±0.70） vs （59.98±3.35），P＜0.001］，既往心房颤动病史比例较高（9.3%vs 3.7%，P=0.048），入院时NIHSS评分较高［11（5～16） vs 5（2～9），P＜0.001］。两组患者在性别、民族、婚姻状况、居住方式、既往吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史等方面差异均无显著性（P＞0.05）。这些患者3个月随访时mRS评分中位数为1分（0～4分），其中预后良好（mRS≤1分）的患者330例，占48.9%。

2.2 SNP83位点基因多态性的分布情况 该位点有2例患者未检测出基因型，检出率为99.70%。由表2可见，该位点的最小等位基因频率（minor allel frequency，MAF）为21%。经卡方检验，该位点符合遗传平衡定律即Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.770，PHEW=0.380）。与未发生联合终点事件患者相比，发生联合终点事件患者中AG+GG基因型的比例较高，且差异具有显著性（50.0% vs 36.7%，P=0.007）。而AG+GG基因型在预后良好和预后不良患者中的分布差异无显著性（38.8% vs 36.8%，P=0.787）。

2.3 SNP83位点基因多态性与缺血性卒中预后的关系 根据以上基因型分布情况，在加性模型（AA vs AG vs GG）和显性模型（AG+GG vs AA）下分析SNP83位点与卒中预后的相关性。由表3可见，在加性模型下，经年龄、既往心房颤动病史和入院时NIHSS评分调整后多因素Logistic分析未发现SNP83位点与联合终点事件的发生相关（OR 1.29，95%CI 0.82～2.05）。而该位点在显性模型下经多因素调整后与联合终点事件发生相关，AG+GG基因型携带者联合终点事件发生风险是AA基因型携带者的1.84倍（95%CI 1.04～3.26），因此G等位基因是卒中发病危险等位基因（表3）。同时，按照国际公认的急性卒中治疗低分子肝素试验病因分型法（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型[9]，对卒中不同亚型进行分层分析，结果并未发现该位点与不同卒中亚型后联合终点事件的发生相关。在加性和显性模型下，经年龄、既往心房颤动病史和入院时NIHSS评分调整后Logistic分析均未发现该位点与卒中预后不良的相关性，并且也未发现其与不同亚型卒中预后不良的相关性（表4）。

表1 有无联合终点事件两组患者基线信息特征

表2 SNP83位点基因型在不同组别中的分布情况

表3 SNP83位点基因多态性与卒中及其不同亚型联合终点事件发生的相关性

3 讨论

PDE4D基因位于人类染色体5q12上，长度大约为1.6 Mb，至少含21个外显子和22个内含子，是一类能特异性水解环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和环磷酸鸟苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），使其转变成失活性的单核苷酸的关键酶，这是cAMP和cGMP降解的唯一途径[10]。cAMP广泛存在于体内各种细胞中，包括血管平滑肌细胞、内皮细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞，在信号转导和生理反应的调控中起着重要作用。研究认为PDE4D的表达增加可导致cAMP的活性降低，进而引起血管平滑肌细胞增生和迁移以及血管受损处局部炎症反应加剧，促进动脉粥样硬化的形成，导致动脉粥样斑块的易损性增加[11-12]。

目前关于PDE4D基因与缺血性卒中发病的相关性的研究较多。2003年来自冰岛人群的研究[3]，表明PDE4D基因的SNP41、SNP45、SNP56、SNP83、SNP87、SNP89与缺血性卒中，尤其是颈动脉源性和心源性卒中明显相关。Saleheen等[13]在包括200例缺血性卒中患者和250例对照的巴基斯坦人群中验证了该基因的SNP83（rs966221）与缺血性卒中的相关性。同时Yadav等[14]在南亚人群中进行的meta分析，也发现PDE4D基因的SNP83位点与缺血性卒中发病相关。但Kuhlenbumer等[15]在德国人群中的研究未发现PDE4D基因与缺血性卒中的关联。Lovkvist等[16]在瑞典西部和南部人群进行的meta分析，亦未发现PDE4D基因SNP45位点与缺血性卒中的相关性。可见目前研究发现，PDE4D基因多态性与缺血性卒中的相关性在不同地区、不同人群中的结果不一致，甚至是相反的[4，17-19]，这可能与不同地区、不同种族人群基因分布情况的差异性有关。

表4 SNP83位点基因多态性与卒中及其不同亚型预后不良的相关性

He Ying等[20]在中国河南人群中研究该基因与中国人群缺血性卒中的相关性，发现PDE4D基因的SNP87（rs918592）与该人群缺血性卒中相关（OR 1.87，95%CI 1.25～2.80），尤其是男性（OR 2.13，95%CI 1.25～3.63）。同时，他们在中国年轻汉族人群（18～45岁）中进行的病例对照研究[21]，显示该位点的A等位基因和AA基因型明显增加中国年轻人群卒中的风险（调整OR，95%CI分别为1.45，1.10～1.91；2.19，1.23～3.90）；同时也发现该基因位点的rs2910829的T等位基因和TT基因型与中国年轻人群缺血性卒中的发生明显相关（调整OR，95%CI分别为2.75，1.97～3.84；6.67，2.58～17.22）。但这两项研究都未按照TOAST分型进行亚型分析。Shao等[22]在中国西南地区对459例卒中患者和462例健康对照人群进行的研究并没有发现SNP45、SNP83、SNP87与缺血性卒中的关联（OR和95%CI分别为1.002，0.99～1.01；0.87，0.69～1.10；0.93，0.73～1.19），也未发现这些基因与按照TOAST分型的不同卒中亚型的相关性。为进一步验证该基因在中国人群中与缺血性卒中的相关性，Liu等[6]对中国人群研究的meta分析发现SNP83在显性和隐性模型下均与缺血性卒中发生相关，并且亚型分析发现该位点与大动脉粥样硬化性卒中的相关性明显，这与最近Yan Yan等[5]的meta分析结果是一致的。在此基础上，本研究探索了PDE4D基因的SNP83位点与缺血性卒中预后（复发、死亡等联合终点事件）的相关性，结果发现该位点的AG+GG基因型与缺血性卒中后联合终点事件发生相关（调整OR 1.95，95%CI 1.10～3.47）。由于基因与卒中不同亚型的遗传度是不同的[23-24]，因此对卒中亚型进行了分层分析。结果发现该位点AG+GG基因型可能与大动脉粥样硬化性卒中后联合终点事件的发生相关（OR 2.10，95%CI 0.95～4.67），但差异无显著性，这可能与本研究样本量不够大有关，有待于进一步扩大样本量继续探讨。该研究亦未发现，该位点与小动脉闭塞性卒中和心源性卒中预后相关，这可能是由于该研究的样本量较小，导致某些基因型在亚组的分布较少而影响研究结果，也可能因为卒中不同亚型的发病机制不同所致[9，25]，这有待进一步扩大样本量继续研究。

本研究发现PDE4D基因SNP83位点与缺血性卒中预后相关，这将为卒中的预防探索新的预防、诊治方案提供思路。但由于该研究为单中心研究，且样本量有限，导致某些基因型频率较少，因此有待大样本、多中心的研究来进一步证实，以便得出更可靠的结论。

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【点睛】

该文章研究PDE4D基因SNP83多态性与缺血性卒中预后的相关性，发现其AG/GG基因型与卒中后联合终点事件发生相关。