HSPA2在人肝癌组织中的表达及临床意义

彭兆意，周喜洋

（天台县人民医院，浙江 天台317200）

·临床研究·

HSPA2在人肝癌组织中的表达及临床意义

彭兆意，周喜洋

（天台县人民医院，浙江 天台317200）

目的探讨原发性肝细胞癌（HCC）组织中热休克蛋白70-2（HSPA2）的表达及临床意义。方法利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和免疫组化法检测120例HCC组织和癌旁组织中的HSPA2 mRNA和蛋白的表达水平，并分析HSPA2蛋白在HCC组织中的表达水平与患者临床病理特征之间的关系。结果RT-qPCR结果显示，HSPA2 mRNA在50例HCC组织中的表达水平明显高于癌旁正常肝脏组织中（2.82±0.19与1.18±0.14，P<0.01）；免疫组化结果显示，在120例HCC标本中，HSPA2蛋白高表达有69例 （57.5%），低表达有51例（42.5%），HSPA2蛋白高表达与肿瘤长径、病理分化程度和肿瘤分期有关（P<0.05），而与年龄、性别、HBsAg状态以及血清AFP水平无关（P> 0.05）。结论HSPA2在人HCC中高表达，其高表达可能与HCC的发生、发展密切相关，可能作为HCC早期诊断和预后预测的指标。

肝癌；HSPA2；热休克蛋白

热休克相关蛋白70-2（heat shock-related 70-kDa protein 2，HSP70-2，HSPA2）是HSP70家族的一个成员，最初发现特异性地存在于精母细胞和精子中，与精子生成有关，被称为睾丸特异性蛋白，后来也被发现存在于其它肿瘤组织中，如乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、鼻咽癌等[1-2]。高表达HSPA2能促进肿瘤细胞增殖，提示其在肿瘤发生中起促进作用[3]，但是HSPA2表达与原发性肝细胞癌（HCC）的临床病理关系研究较少，本文通过RT-qPCR法和免疫组化法检测HSPA2 mRNA和蛋白在肝癌组织以及癌旁组织中的表达，探讨HSPA2

与HCC的临床病理关系，以了解HSPA2在肝癌发生发展中的作用及其临床意义。

1 材料与方法

1.1材料 收集2010~2013年间在本院手术切除的120例原发性肝癌组织及癌旁组织，其中男67例，女53例，年龄35~68岁，平均（54.1±6.3）岁，癌旁组织指距离肿块>2cm的正常肝组织，所有病例术前均未行放化疗以及介入治疗，同时收集患者的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤长径、乙肝抗原是否阳性、组织分化程度、术前血清甲胎蛋白（AFP）浓度和肿瘤分期等。120例原发性肝癌组织及其癌旁组织行免疫组化检测，随机选择其中50例肝癌组织及癌旁组织，新鲜标本取出后立即放入液氮中保存，用于行RT-qPCR检测。整个实验的检测部分在浙江大学医学院附属第一医院肿瘤外科实验室完成。

1.2方法

1.2.1实验试剂 RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒 （PrimeScript RTPCR Kit）和定量PCR试剂盒 （SYBR Premix Ex Taq）购自于日本Takara公司；抗-HSPA2多克隆抗体和二抗均购于美国cell signaling technology公司；二氨基联苯胺底物试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；小牛冻干血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自美国Sigma公司。人HSPA2基因引物序列和内参基因β-actin的引物序列均由上海吉玛公司设计合成，见表1。

1.2.2RT-qPCR 采用RT-qPCR的方法来检测标本中HSPA2 mRNA的含量，组织标本加入1mL Trizol后用匀浆器研磨，加入200μL氯仿，剧烈震荡15秒，室温静置10分钟后，12000rpm/min，4℃离心15分钟，吸取上层水相加入等体积预冷的异丙醇置于-20℃30分钟，再用12000rpm/min，4℃离心15分钟后弃上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 2000（美国）检测总mRNA浓度。根据逆转录试剂盒操作，制备cDNA产物，以β-Actin为内参，以逆转录产物为模板，在实时定量PCR仪 （First7500美国）上进行PCR扩增。PCR扩增体系：10μL 2×SYBR Green Mix，正反链引物各1μL，4μL逆转录产物，加灭菌双蒸水至总反应体积20μL。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃30秒，56℃ 30秒，72℃2分钟，共40个循环，采用相对定量方法计算靶mRNA相对表达量。

1.2.3免疫组织化学检测 石蜡标本切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，3%H2O2清除内源性过氧化物酶，高温高压修复。1%BSA封闭，滴加适当稀释一抗（1:100），室温内放置2~3小时，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗。滴加二抗，室温内放置20分钟，PBS清洗。DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。以已知的阳性表达的组织切片为阳性对照，PBS替代特异性一抗为阴性对照。

1.2.4结果判定 由2位病理学医师对免疫组化结果进行评估。在高倍显微镜下，每张切片随机选择5个视野，观察计数100个肿瘤细胞。采用计分半定量法分析：（1）按阳性细胞百分比计分：无阳性细胞，0分；1%~10%阳性细胞百分比，1分；11%～35%，2分；36%～70%，3分；>70%，4分；（2）按着色强度计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞百分比评分和着色强度评分相乘，>6分为高表达，<4分为低表达。

1.3统计学处理 数据采用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料数据采用（）表示，两两比较用t检验，计数资料的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1RT-qPCR检测HSPA2 mRNA在肝癌组织和癌旁组织的表达 50例HCC组织中的HSPA2 mRNA表达水平比50例癌旁组织的表达水平显著升高（2.82±0.19与1.18±0.14，P<0.01），见图1。

2.2免疫组化法检测HSPA2蛋白在肝癌组织和癌旁组织中的表达 免疫组化结果显示，120例肝癌组织标本中，HSPA2蛋白在69（57.5%）例中高表达，51（42.5%）例中低表达，在癌旁组织中，HSPA2蛋白有8（6.7%）例高表达，112（93.3%）例低表达，与肝癌组织比较，差异有统计学意义（P<0.01），见图2~3、表2。

2.3HSPA2表达与临床病理特征的关系 HSPA2蛋白高表达与肿瘤长径、病理分化程度和肿瘤分期有关均（P<0.05），而与年龄、性别、HBsAg状态以及血清AFP水平无关（均P＞0.05），见表3。

3 讨论

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，进展快、死亡率高，由于肝癌早期症状不明显，诊断的时候往往已是晚期，失去手术机会，而且肝癌对放化疗不敏感，因此，探索HCC的发病机制以及早发现和早诊断非常重要[4]。AFP是目前应用最广泛的肝癌肿瘤标志物，但是特异性和敏感性不高，在活动性肝病，妊娠、生殖腺胚胎源性肿瘤和少数消化道肿瘤中也可有AFP的增高，显示AFP诊断肝癌的局限性[5]。因此寻找一种能早期诊断HCC的标志物有着重要的临床意义。

HSP是一组在进化上高度保守的蛋白质，广泛存在于原核和真核生物中，调控细胞生长、发育、分化、蛋白合成、细胞骨架的功能等，与细胞的转化和恶变过程密切相关[6]。HSP能与多种蛋白质在细胞内形成复合体进而调节靶蛋白的活性和功能，故也被称为 “分子伴侣”[7]。根据分子量以及等电点的不同，HSP可分为HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族，其中，HSP70一族是在细胞内含量最高和功能最重要的热休克蛋白，它通过参与原癌基因c-myc、c-fos和抑癌其因p53及其蛋白产物的相互作用来调节细胞的增殖[8]。下调肺癌细胞株A549的HSP70表达，不仅可以抑制肿瘤细胞增殖还可诱导凋亡，提示HSP70可能作为一种重要的基因控制着肿瘤细胞的增生及凋亡[9]。Yang等[10]通过微阵列检测肝癌组织发现，HSP70在早期肝癌中过表达，可能是由于肿瘤形成后血液供应不充分处于营养缺乏和低氧应激环境下刺激 HSP70合成，致HSP70表达增加，是区分早期肝癌与癌前病变如酒精性肝病或非癌肝组织等的敏感标志物。

HSPA2是HSP70家族成员，早期对HSPA2功能的研究局限在精子发育方面。近年研究表明，HSP70在许多恶性肿瘤中高表达，可与凋亡信号通路中的关键蛋白和激酶相互作用抑制肿瘤细胞凋亡，沉默HSPA2后可通过影响细胞周期和线粒体凋亡通路抑制肝癌细胞的增殖[11]。

本文结果显示，HSPA2基因在HCC肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织，免疫组化结果显示，在癌旁正常肝组织中HSPA2不表达或低表达，而在HCC组织中，HSPA2呈过表达状态，且与肿瘤长径、分化程度以及分期有关，表明HSPA2蛋白与肝癌的发生、发展及迁移有关，早期患者HSPA2即表现为过表达，提示可能作为早期诊断的标志物，HSPA2的表达与肝癌患者的预后还需要进一步地研究。

总之，研究HSPA2在肝癌发生发展中的作用，有利于更加深入地了解肝癌的发病机制，既往研究显示消除HSPA2能够促进肝癌细胞凋亡，说明HSPA2对肝癌细胞的发生发展有关键作用，因此，治疗上利用HSPA2的抑制剂来抑制HSPA2的合成，将有可能控制肿瘤生长，也许能为今后治疗肝癌提供一种新的思路。

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[4] Yang JD，Roberts LR.Hepatocellular carcinoma:a global view.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7（8）:448

[5] 徐海峰，杨华瑜，张宏冰，等.改变肝癌早期诊断和治疗现状的新肝癌血清标志物.基础医学与临床，2008，28（1）:104

[6] Zhao JH，Meng XL，Zhang J．Oxygen glucose deprivation post-conditioning protects cortical neurons against oxygenglucose deprivation injury:role of HSP70 and inhibition of apoptosis.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2014，34（1）:18

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[9] 刘先领，刘伏友，李桂源，等.HSP70在放线菌素D所致肺腺癌细胞增殖抑制和凋亡中的作用.生物化学与生物物理进展，2007，34（1）:42

[10]Yang Z，Zhuang L，Szatmary P，et a1.Up regulation of heat shock proteins（HSPA12A，HSP90B1，HSPA4，HSPA5 and HSPA6）in tumour tissues is associated with poor outcomes from HBV-related early-stage hepatocellular carcinoma.Int J Med Sci，2015，12（3）:256

[11]夏丽敏，田德安，张琼，等.抑制HSP70-2基因表达诱导肝癌细胞G2/M期阻滞的机制研究.胃肠病学和肝病学杂志，2008，17（12）:966