EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌组织中的表达及诊断意义

龚梁，陈建强，鲁杰，熊华，邹坚定，陈亮宇

（温州医科大学附属慈溪医院，浙江慈溪315300）

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌组织中的表达及诊断意义

龚梁，陈建强，鲁杰，熊华，邹坚定*，陈亮宇

（温州医科大学附属慈溪医院，浙江慈溪315300）

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP-1）在鼻咽癌（NPC）组织中的表达，为早期筛查诊断NPC提供依据。方法采用MaxVision免疫组化的方法检测60例NPC组织和60例鼻咽炎组织中的LMP-1表达，分析LMP-1阳性表达与NPC临床病理特征的关系。结果LMP-1在NPC组织中的阳性表达率为63.3%（38/60），LMP-1在鼻咽炎组织中的阳性表达率为6.7%（4/60），差异有统计学意义（P<0.05）；LMP-1的表达与TNM分期、淋巴结转移和临床分期有关（P<0.05）；LMP-1筛查鼻咽癌的灵敏度为63.3%，特异度为93.3%，阳性预测值为0.905，阴性预测值为0.718，ROC曲线下面积为0.811（95%CI：0.731~0.891）。结论NPC组织中LMP-1的表达与TNM分期、淋巴结转移、临床分期有关，鼻咽组织中的LMP-1表达筛查鼻咽癌具有较高的特异度，辅助诊断NPC具有可行性。

EB病毒；鼻咽癌；潜伏膜蛋白1；诊断试验

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）在中国是常见的恶性肿瘤之一。鼻咽癌的诊断，目前主要依赖于鼻咽镜检查和对病变组织的病理学检查[1]，但因上述检查皆具侵袭性，有部分患者不能一次明确病理诊断，需要反复多次进行活检取材，故非鼻咽癌普查和疾病监测的理想手段。目前发现，EB病毒的潜伏膜蛋白 1（latent membrane protein-1，LMP-1）基因是重要的致癌基因[2]，LMP-1是由EB病毒编码的膜蛋白之一，EB病毒使细胞产生恶性转化可能是通过致癌基因LMP-1实现的。因此，本文通过检测鼻咽部标本中的LMP-1表达来评估其诊断鼻咽癌的灵敏度和特异度，为早期筛查诊断鼻咽癌提供依据，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年1月～2014年12月本院诊治的鼻咽癌患者60例作为观察对象，所有患者均经过活检组织病理确诊，实验室保存NPC患者的鼻咽组织标本。60例NPC患者中，男47例，女13例；年龄25~76岁，平均（57.6±9.4）岁；高分化鳞癌8例、低分化鳞癌32例、未分化癌20例；有淋巴结转移37例、无淋巴结转移23例；所有患者均未接受放疗、化疗等治疗。收集同期住院的鼻咽炎患者60例作为对照组，排除鼻咽癌、鼻息肉、鼻窦炎，收集鼻咽组织标本。60例对照组中，男35例，女25例；年龄33~70岁，平均（54.8±8.1）岁。

1.2方法 经病理活检采集NPC组和对照组患者的鼻咽组织标本。LMP-1试剂盒采购于武汉中美科技有限公司，MaxVision免疫组化和DBA显色试剂盒由福州迈新公司提供。具体步骤：组织石蜡切片，厚4μm，60℃恒温箱内烤片1小时。二甲苯脱蜡和水化，酒精梯度脱二甲苯，蒸馏水清洗。微波法修

复抗原，置于3%H2O2溶液中室温下孵育30分钟，以去除内源性过氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封闭液，37℃孵育10分钟。滴加一抗，4℃过夜，PBS清洗。滴加二抗，37℃孵育20分钟，PBS清洗。加链霉菌生物素—过氧化物酶溶液，37℃孵育20分钟，PBS清洗。DAB显色剂显色，苏木素复染，片烤干，封片，光镜下观察。免疫组化检测结果的观察及判断细胞计数：以细胞质呈弥漫棕黄色细小颗粒为阳性细胞，每张切片上皮层随机取8幅视野，采用全自动图像分析仪对阳性细胞进行计数，在100倍显微镜下记录视野中的阳性细胞数。光镜下观察阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，≤10%为1分，＞10%~50%为2分，＞50%~75%为3分，＞75%~100%为4分。染色强度：细胞质无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性细胞百分比与染色强度的乘积≥3判定为LMP-1表达阳性[3]。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，检验水准α=0.05；计数资料比较采用χ2检验；诊断试验采用受试者工作曲线（ROC曲线）分析法。

2 结果

2.1LMP-1的表达 LMP-1在NPC组织中的阳性表达率为63.3%（38/60），LMP-1在鼻咽炎组织中的阳性表达率为6.7%（4/60），差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2LMP-1表达与临床及病理的关系 通过免疫组化发现，LMP-1的表达与TNM分期、淋巴结转移和临床分期有关（P<0.05），见表1。

2.3LMP-1免疫组化筛查鼻咽癌 由表2可知，LMP-1筛查鼻咽癌的灵敏度为63.3%，特异度为93.3%，阳性预测值为0.905，阴性预测值为0.718，ROC曲线下面积为0.811（95%CI：0.731~0.891），说明LMP-1免疫组化试验筛查鼻咽癌的特异度较高，而灵敏度较差，见图2。

3 讨论

鼻咽癌与EB病毒有密切关系，主要原因有[4-5]：（1）从鼻咽癌组织中分离出带EB病毒的类淋巴母细胞株的阳性率为68.7%，在电镜下少数带有EB病毒抗原的细胞中可找到EB病毒颗粒；（2）鼻咽癌患者体内的EB病毒抗体水平随病情的发展而变化；（3）EB病毒在人以外灵长类或其他动物体内引起鼻咽癌；（4）几乎所有的鼻咽癌组织中均可检测到EB病毒基因组的存在。虽然EB病毒在成人中广泛存在，但并非所有感染EB病毒的细胞都会表达致癌基因LMP-1，所以并非所有的EB病毒感染者都会发生鼻咽癌，绝大多数人群只是EB病毒的慢性携带者而不表达致癌基因LMP-1。通过检测LMP-1的表达来诊断鼻咽癌，可能比检测EB病毒基因组或EB病毒的血清VCA-IgA抗体具有更高的特异性。有研究表明，利用免疫组化技术可在50%～70%的鼻咽癌患者活检组织中检测到LMP-1的表达，本文的NPC患者鼻咽组织中LMP-1阳性表达率为63.3%，低于林锦等[6]报道PCR检测LMP-1阳性表达率88.4%。

LMP-1表达与鼻咽癌其他临床病理参数是否有关，目前研究报道未完全一致。本文结果显示，TNM分期和临床分期越高，LMP-1的阳性表达率越高，这说明晚期鼻咽癌（T3-T4期、III-IV期）组织中的LMP-1阳性表达率高于早期鼻咽癌（T1-T2期、I-II期）组织，提示LMP1表达可能与鼻咽癌的进展密切相关。LMP-1是目前被证实具有癌基因编码蛋白的EB病毒基因产物。这与姜武忠等[7]报道的结果相似，而林锦等[6]报道的结果则无统计学意义，这可能与其样本量较小有关。本文结果显示发生淋巴结转移组的 LMP-1阳性表达率为78.38%，明显高于未发生淋巴结转移组的39.13%，显示LMP-1阳性表达与远处淋巴结转移有关，与李蓉等[8]报道结果相似。若能在NPC患者初诊时就做LMP-1检测可以预测NPC患者的转移潜能，作为随访和评价预后的指标之一，可以指导临床制定NPC的个性化治疗方案，还可以为抗肿瘤转移的靶向治疗提供必要依据。本文尝试采用免疫组化的方法来检测鼻咽组织的LMP-1表达来诊断NPC，灵敏度为63.3%，特异度为90.3%，这说明LMP-1有助于辅助诊断NPC。但考虑到免疫组化法所检测LMP-1表达筛查NPC的灵敏度较低，Hao等[9]报道，采用PCR法定量检测EB病毒DNA可获得更高的灵敏度和特异度，Raymond等[10]报道的灵敏度、特异度分别达到98.9%、99.3%。因此，本课题组下一步也将尝试鼻咽拭子标本采用PCR法来检测LMP-1基因，来确定其筛查NPC的诊断效果。

[1] Kathy H.Y Shair，Caroline I.Schnegg，Nancy Raab-Traub. Epstein-BarrVirus Latent Membrane Protein-1 Effects on Plakoglobin，Cell Growth and Migration.Cancer Res，2008，67（17）:6997

[2] 陈育华，周克元，袁汉尧.EB病毒潜伏膜蛋白1的研究进展.医学综述，2009，15（2）:170

[3] 刘鲁新，管小猛.鼻咽癌组织中潜伏膜蛋白的表达变化及意义.山东医药，2010，50（6）:36

[4] 刘文斌，罗非君，曹亚.EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌侵袭和转移的研究进展.国际病理科学与临床杂志，2010，30（6）:484

[5] 刘涛，赵菊梅，梁传余.EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的研究进展.现代肿瘤医学，2009，17（4）:757

[6] 林锦，郭巧娟，韩露，等.EB病毒潜伏膜蛋白LMP-1在鼻咽癌中的表达及临床意义.实用癌症杂志，2010，25（6）:564

[7] 姜武忠，赵素萍，廖遇平，等.鼻咽癌组织中LMP1和VEGF蛋白表达及其临床意义.中国耳鼻喉颅底外科杂志，2007，13（3）:173

[8] 李蓉，敬敏，黎小兵，等.EB病毒潜伏膜蛋白1介导的上皮一间质转化增强鼻咽癌的转移潜能.肿瘤，2011，31（7）:627

[9] Hao SP，Tang NM，Chang KP，et al.Differentiation of recurrent nasopharyngeal carcinoma and skull base osteroradionecrosis by Epstein2Barr virus2derived latent membrane protein-1 gene.Laryngoscope，2001，111（4）:650

[10]Raymond HW Ng，Roger Ngan，William Ignace Wei，et al. Trans-Oral Brush Biopsies and Quantitative PCR for EBV DNA Detection and Screening of Nasopharyngeal Carcinoma. Otolaryngology-Head and Neck Surgery，2014，150（4）:602

浙江省自然基金（LY12H13002），浙江省医药卫生科技计划（2015RCB026），浙江省中医药重点研究计划 （2012ZZ012），浙江省中医药科技计划项目 （2015ZB107、2013ZB115），宁波市自然科学基金（2012A610205、2012A610206），慈溪市科技计划项目（CN2013013）

*为通讯作者，E-mail：u78ua@126.com