重症肌无力免疫学机制研究进展

李媛 楚兰 张艺凡

重症肌无力免疫学机制研究进展

李媛 楚兰 张艺凡

重症肌无力(MG)是一种神经肌肉接头(NMJ)传递障碍的获得性自身免疫性疾病，发病机制主要以体液免疫为主、细胞免疫依赖及补体参与。研究表明，MG的发病与多种淋巴细胞及其亚群、抗体、补体及各种细胞因子之间复杂的相互作用有关。故了解MG的免疫学发病机制对MG的诊断及治疗有重大意义。

重症肌无力；淋巴细胞；抗体；细胞因子

1 T淋巴细胞亚群

T细胞表面有多种标志性抗原。按照功能和表面标志可以分成很多种类：(1)辅助T细胞(helper T cell，Th)：它可以通过增生扩散来激活其他类型的免疫细胞，其主要表面标志是CD4。Th细胞调控或辅助其他淋巴细胞发挥功能；协助活化B细胞产生抗体；也可协助杀伤性T细胞及巨噬细胞发挥免疫功能。(2)细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，Tc)：它可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭，其主要表面标志是CD8。(3)调节/抑制T细胞(regulatory/suppressor T cell，Treg)：负责调节机体免疫反应。对各种T细胞和B细胞都有抑制作用，调节和控制免疫反应，维持免疫自稳性(即免疫耐受性)。

1.1 CD4+细胞 CD4+细胞也称为Th，初始CD4+T细胞接受抗原刺激后首先分化为Th0细胞。Th0细胞继续分化为3种Th细胞亚群，即Th1、Th2和Th3细胞。研究表明：MG患者的Th1和Th2细胞的免疫活性均有增强，它们可能通过细胞因子作用于AChR特异性B细胞，从而激活体液免疫。而Th3细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)主要发挥抑制作用。

Th1细胞主要分泌白细胞介素-2(IL-2)、IL-12、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，启动细胞免疫[3]，激活巨噬细胞及细胞毒性T细胞，参与迟发型超敏反应[4]。IL-2是Th1细胞最主要的生长、分化因子，可诱导Th1细胞增殖及产生IFN-γ、激活巨噬细胞、刺激NK细胞、促进B细胞增殖及分泌抗体，主要起免疫增强作用[5-6]。Liu等[7]研究发现，向自身免疫性重症肌无力(EAMG)小鼠体内注入IL-2/抗IL-2的单克隆抗体(mAb)免疫复合物可有效地促进功能性调节性T细胞增殖，进而抑制AChRAb，减轻小鼠的MG症状。硫唑嘌呤、环孢素均具有抑制IL-2与其受体结合的作用，从而达到减轻MG患者临床症状。IL-12主要由巨噬细胞和B细胞等抗原呈递细胞产生，可诱导Th0细胞向Th1细胞的分化，诱导其产生IFN-γ[5-6]。在C57BL/6(B6)大鼠体内同时注射电鳐AChR免疫原(TAChR)与IL-12发现，其血清抗TAChR IgG2a抗体水平比单独用TAChR免疫的大鼠高，表明在MG的发病中IL-12起致病作用[8]。IFN-γ是一种同源二聚体糖蛋白，具有多种免疫调节功能，能够增加MHCⅡ类分子的表达、激活巨噬细胞，在诱导B淋巴细胞成熟并辅助AChRAb的产生、诱发EAMG临床症状产生中起重要作用[3]。实验证明，Lewis大鼠诱导EAMG的同时给予大鼠IFN-γ皮下注射可使诱导的EAMG临床症状明显加重，同时AChRAb和Th1细胞水平也明显增高。推断IFN-γ是一种促MG的免疫因子。TNF-α主要由活化的巨噬细胞、单核细胞和T细胞产生，是炎性反应和免疫调节的重要因子，可诱导广泛的炎性级联反应并诱导抗原提呈细胞(APC)的活化[4, 6]。许多研究表明TNF通过其受体介导的信号转导系统参与了MG的发病。国外学者发现：MG患者TNF-α-308位点A基因频率显著增加，尤其是胸腺增生的患者中，且此趋势在女性、早发型患者中更为明显，而且TNF-α-308A(+)MG患者外周血单个核细胞分泌TNF-α增加，均提示TNF基因多态与TNF的分泌有关，导致MG患者免疫系统紊乱。

Th2型细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等细胞因子，可促进B细胞的增殖、分化和抗体的形成，故Th2细胞的主要作用是辅助特异性B淋巴细胞增殖并产生AChRAb,启动体液免疫应答[3]。下调巨噬细胞及细胞毒性T细胞的功能，参与IgE介导的变态反应的致病过程，Th1和Th2的相互作用通过其分泌的细胞因子的叠加、协同，或者拮抗等方式发挥作用[4]。IL-4为Th2的特征性细胞因子，可刺激B细胞增殖及IgG合成，在抗体合成及其类型的转换过程中必不可少。一些学者认为IL-4是B细胞活化的启动因子，可介导AChR活化的淋巴细胞产生 AChRAb，参与MG的病理进程。然而另外一部分研究认为IL-4能通过抑制Th1细胞的功能来抑制细胞免疫[8]。因此IL-4在MG发病中的具体作用尚不明确，有待进一步研究[6]。IL-5主要由CD4+Th2细胞和激活的肥大细胞产生，可促进B细胞分化与生长，诱导嗜酸性粒细胞分化，促进IgA合成，诱导细胞毒T细胞(CTL)的生成[8]。国外学者进行IL-5基因敲除造模EAMG发现其后代发病率较正常组低也证明了IL-5的致病性[9]。IL-10是由178个氨基酸组成的相对分子质量为18 000的多肽，基因位于1号染色体，可抑制巨噬细胞的抗原呈递功能和Th1细胞应答，间接抑制NK细胞活性[10]。目前对IL-10的作用尚有争论：一些学者认为IL-10可加重EAMG的病情；然而另有研究发现胸腺未切除的MG患者外周血单个核细胞IL-10基因表达减少。尽管具体的机制尚未阐明，但初步可证实IL-10多态性参与了MG的病理过程[11]。

Th3细胞分泌的TGF-β主要效应功能是抑制Th1细胞介导的免疫应答和炎性反应。近年来发现，TGF-β是一种重要的内源性免疫抑制性细胞因子，可抑制免疫活性细胞的增殖，如可以抑制IL-2、IL-6联合诱导的胸腺细胞的增生，抑制淋巴细胞的增殖和分化，并降低其活性，还可以抑制促炎性细胞因子的生成，如IFN-γ和TNF-α等[5]。研究人员从EAMG的血清检测中发现小鼠MG症状的好转往往伴随有TGF-β水平的升高[12]；也有学者报道，MG患者外周血单个核细胞TGF-β水平高于正常对照组，且TGF-β水平与病程有关，表明MG患者在启动免疫激活机制的同时也启动了免疫抑制机制。在MG患者中由于某些原因导TGF-β浓度降低,它所介导的FOXP3的表达降低，从而Treg细胞的数量或者免疫抑制功能降低或者缺陷,对T、B细胞的活化与增殖的抑制作用降低, 最终导致AChRAb的产生增多。这可能是引起MG患者机体免疫平衡失调、产生抗体的机制之一,在MG患者发病中发挥重要作用[13]。这些研究均提示通过提高TGF-β，使Th1、Th2及Th3细胞之间达到相对平衡，以达到重建体内免疫稳态。这可能成为一种有前景的免疫治疗方法。

1.2 CD8+细胞 CD8+细胞也称为抑制性T淋巴细胞(Ts)，主要通过两种机制发挥细胞毒作用：一是分泌穿孔素、颗粒酶、颗粒溶解素及淋巴毒素等物质直接杀伤靶细胞；二是通过Fas/FasL途径诱导靶细胞凋亡。Th细胞与Ts细胞构成一个错综复杂的免疫调节系统，生理情况下处于动态平衡。对于免疫应答的调控和免疫自稳均具有重要意义，一旦失调将导致病理性反应。但是CD8+T细胞作为抑制性T细胞，其如何参与MG的发生目前尚存在争议[14]。大部分学者达成以下共识：MG患者外周血中CD3+、CD4+细胞百分率升高，CD8+细胞百分率降低，CD4+/CD8+比值增高[4]。

1.3 Treg细胞 CD4+CD25+Treg的主要功能是通过抑制性调节CD4+和CD8+T细胞的活化与增值，达到免疫的负调节作用。人类自身免疫疾病常常被冠以CD4+CD25+Treg细胞相对缺乏的特点。Liu等[7]依据此原理，将含有IL-2和抗IL-2的mAb组成的免疫复合物注射至EAMG模型中后发现，Treg细胞在该实验模型中出现持续并且有效的增长。增殖的Treg细胞可能抑制T细胞及B细胞对AChR的自体反应，同时减缓肌肉无力的症状[15]。综上，Treg细胞主要产生于正常胸腺，是一种功能成熟的T细胞亚群，其具有抑制抗原特异性反应性T细胞免疫反应的功能，也与免疫耐受的维持有关。同时国内外研究人员发现Treg细胞的比值下降与EAMG的发病有着密切关系，故调节Treg细胞水平对MG未来的治疗有着重要的意义。

2 B淋巴细胞亚群

B淋巴细胞(B-lymphocytes)是体液免疫的主导细胞，起源于骨髓，发育成熟后进入外周血淋巴细胞池(主要包括脾脏、淋巴结等)。外周B淋巴细胞通常处于静息状态，若遇到特异性抗原与相关细胞因子的刺激，会被诱导成活化性B淋巴细胞，并在APC与Th细胞的协助下，通过一系列复杂的细胞信号传导机制，诱导B淋巴细胞转化成分泌特异性抗体的浆细胞以及记忆性B淋巴细胞，发挥免疫作用[16]。在正常情况下，胸腺B淋巴细胞的数量只占1%，但在MG患者的胸腺中却发现大量B淋巴细胞聚集，并形成典型的生发中心(germinal center)，被认为是MG发生发展的关键病变。在不明原因促发的炎性反应下，补体系统被激活，上述细胞被破坏，大量AChR和MuSK等释放，在趋化因子的介导下，外周大量B淋巴细胞聚集到胸腺当中，形成生发中心，随后Treg细胞调节功能出现异常，静息B淋巴细胞被活化，各种APC(如树突状细胞、巨噬细胞等)将AChR和MuSK提呈给活化B淋巴细胞，诱导B淋巴细胞转化成分泌抗AChRAb或抗Musk-Ab的浆细胞，进入血液循环，导致MG发病[17]。免疫抑制剂中环磷酰胺对B细胞有很强的抑制作用；利妥昔单抗通过多种机制清除体内B细胞，故均被推荐用于难治性MG。

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CD21，即补体受体2(complement receptor 2)，表达在各阶段的B淋巴细胞膜，与补体系统之间存在密切的联系，并随着B淋巴细胞的活化而逐渐升高。主要分布在B细胞胞膜上，在B细胞表面分为胞外域、跨膜域和胞质尾区，C3d、C3dg、iC3b等补体免疫复合物可以通过CD21这一受体活性激活B细胞，使B细胞分泌特异性抗体。国内研究结果显示MG患者AChR和CD21双阳性的B细胞显著高于健康对照人群，提示MG患者存在特异性B细胞的过度激活[18]。

CDl9，主要表达在B淋巴细胞膜中的一种跨膜蛋白，其参与CD21、CD8l、Leu31组成的复合物，协助B细胞抗原受体对特异性抗原的辨别及B淋巴细胞的活化；并在生发中心形成及B淋巴细胞向浆细胞转化过程中具有独立的促进作用，但CD19最重要的作用在于降低B淋巴细胞摄取抗原的阈值，提高B淋巴细胞对外源性抗原的识别能力，是B淋巴细胞抗原识别与摄取状态的关键标记物，并通过介导活化B淋巴细胞与抗原间的作用来维持B淋巴细胞的活性[19]。

B细胞活化因子受体(BAFF-R)属于肿瘤坏死因子受体家族的一员。BAFF是B细胞的重要存活因子，可由单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及中性粒细胞表达，主要与B细胞表面的BAFF-R结合，介导B细胞分化、增殖和存活。有研究表明MG患者外周血中CDl9+BAFF-R+B细胞明显增加，提示与发病机制有关。易芳芳等研究表明对难治性MG患者采用小剂量他克莫司治疗后，患者体内外周血CDl9+BAFF-R+B细胞数量有所降低[20]。

CD93，一种跨膜糖蛋白，前B淋巴细胞可见其表达，另外在浆细胞中也有表达。近期研究发现CD93具有维持浆细胞抗体分泌及延长浆细胞生命的功能，能体现出体液免疫的终末状态[21]。

3 AChRAb

AChR主要集中于神经细胞和肌细胞之间的突触，由两个α和β、γ、δ亚单位各一个组成的五聚体，这些亚单位排列为类似长管状，形成穿越细胞膜的通道。其中α蛋白亚单位是细胞膜外结合乙酰胆碱的主要位点，包括被抗乙酰胆碱自身抗体识别的主要免疫原区。大多数AChRAb都直接作用于该区发挥作用。当乙酰胆碱识别AChR上的两个细胞外α部位时，受体结构发生细微变化，即通道开放阳离子进入细胞膜内，形成终板电位导致肌肉收缩。

AChRAb有不同的亚型，在AChR-MG患者(即MG患者血清中可检测出AChRAb)体内主要是IgG1和IgG3亚型，可激活补体共同参与免疫反应。IgG1和IgG3亚型的AChRAb主要有3种致病机制：(1)在突触后膜上结合补体，最终形成膜攻击复合物；(2)结合突触后膜上的AChRs，导致AChR的内吞和退化；(3)可阻断乙酰胆碱和AChR的结合或者使离子通道关闭[22]。国内外许多研究研究表明，抗AChRAb的滴度与疾病的严重程度无明显关系。

根据Zhang等报道，大约占85%的全身型及50%的眼肌型MG患者血清中可检测出AChRAb，即AChR-MG[23]。但是这个比例在中国人种中比例有所降低，大约占51.2%～66.0%[24]。AChR-MG主要根据其临床症状和发病机制分为早发型MG、迟发型MG和伴发胸腺瘤MG。早发型MG指发病年龄小于40周岁。其首发症状常为眼外肌无力，随后病情逐渐进展，发展为全身肌肉无力。该型MG通常会出现胸腺增生，其生发中心刺激B细胞对AChR反应。迟发型MG患者发病年龄大于60周岁，大多数患者胸腺正常或萎缩；伴发胸腺瘤的AChR-MG主要见于老年MG患者。同时需注意的是各种胸腺异常，如胸腺增生、胸腺瘤等均常见于AChR-MG。治疗方面：AChR-MG患者对乙酰胆碱酯酶抑制剂及糖皮质激素较为敏感，一般情况下，治疗效果尚可。

4 MuSK-Ab

肌肉特异性酪氨酸激酶(muscle specific tyrosine kinase，MuSK)是一种突出后膜蛋白，相对分子量为110 000，其细胞外区由4个IgG样区域和一个半胱氨酸聚集区构成，细胞内区由一个近膜区、一个激酶区和C末端尾部组成[25]。MuSK蛋白对NMJ的发育扮演着重要的作用。在这一过程中运动神经元轴突生长并分泌集聚蛋白，聚集蛋白与肌肉细胞膜表面的MuSK相互作用，从而激活NMJ发育的信号级联。同时MuSK也是AChR聚集的必备蛋白，研究证实从神经末梢释放出来的肌联蛋白通过LRP4/MuSK/Dok-7/Rapsyn/AChR通路使NMJ后膜上的AChR聚集和胞内信号转导引起NMJ后膜下细胞核AChR转录增加。MuSK并非仅参与NMJ的发育，其在NMJ成熟后的结构维持和再生中也发挥着重要作用[26]。与AChRAb不同，MuSK-Ab主要是IgG4亚型，这类亚型不结合补体，它主要与MuSK的1-2IgG样结构域相结合发挥其致病作用。在MuSK-Ab诱导的EAMG动物模型中，NMJ后膜的AChR及MuSK受体数量下降，正常而复杂的NMJ后膜上接头褶皱出现明显的结构简化现象。表明MuSK-Ab与MuSK受体分子的结合加速了后者的降解或直接抑制后者功能，使得NMJ超微结构破坏，进而导致AChR的信号输出减少，肌细胞动作电位阈值增加，出现NMJ的信号传导障碍，最终出现MG症状。

2001年，Hoch等[27]发现大约有70%抗AChRAb阴性的患者可检测出MuSK-Ab(即MuSK-MG患者)。但是国内外文献报道该抗体阳性比例各有不同，这种区别是源于种族、环境及检测方法的差异因素。通过对这些患者的临床表现分析得出，MuSK-Ab阳性的患者常常累及面肌、延髓及呼吸肌等，导致严重的临床表现，同时可出现肌肉萎缩，但这些患者较少累及眼肌，较少出现胸腺的异常。与AChRAb明显不同的是，多数文献均有报道MuSK-MG患者病情的严重程度与血清MuSK-Ab滴度呈正比[28]。治疗方面：该类患者通常对乙酰胆碱酯酶抑制剂疗效欠佳，国内外文献均显示采用血浆置换、静脉注射免疫球蛋白及联合应用免疫抑制剂治疗较单用乙酰胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素治疗效果更佳[29]。

5 LRP4-Ab

低密度脂蛋白受体相关蛋白4(LRP4)是低密度脂蛋白受体(LDL-R)家族中的一员，LDL-R家族成员具有相似的分子结构，包括1个跨膜结构，1个长的细胞外N末端和1个短的细胞内C末端。在细胞外的部分拥有一个配体结合区域，此区域可和多种蛋白结合发挥作用[26]。LRP4和运动神经元轴突释放的聚集蛋白结合后与突触后膜上的MuSK形成三聚体复合物。该复合物使MuSK细胞内的部分磷酸化，从而被激活。一旦MuSK发生了酪氨酸磷酸化，MuSK细胞内的部分会招募Dok-7这个肌肉特异性衔接蛋白。Dok-7的聚集和磷酸化使得突触后膜上的AChR蛋白累积，这对突触信息传递的稳定性及准确性将产生必要作用。聚集蛋白结合LRP4的有效区域后加强了LRP4与MuSK之间的结合(LRP4与MuSK之间的结合区域是8个LDLα区域中的后5个和4个β螺旋区域中的前3个，也就是说LRP4结构中第4、5个LDLα重复区域与第3个β螺旋在结合聚集蛋白时并不需要，但是这个区域对于LRP4结合MuSK却至关重要)并刺激MuSK激酶活化[30-31]。LRP4同时还是Wnt信号通路上的阻断剂，其介导的信号通路涉及骨骼肌的形成及肾脏发育等方面。总之，LRP4与其他蛋白一起对NMJ的形成及维持扮演着不可或缺的重要作用。

文献显示，现约有2%～50%(世界范围内报道比例各不相同，推测原因可能与种族、环境及检测方法存在差异有关)的患者体内不能发现AChRAb或MuSK-Ab，即所谓的血清学双阴性的MG患者。但近年来研究发现，一些血清学双阴性的MG患者中可检测出LRP4-Ab[32-33]，即LRP4-MG。

Higuchi等[32]证实LRP4-Ab能干扰聚集蛋白与LRP4的结合，从而影响NMJ后膜上AChR聚集。LRP4-Ab也属于IgG1亚类，能够激活补体。故可推测LRP4-Ab致病机制可能和AChRAb导致MG的机制相似，即抗体激活补体致突触后膜损伤、促使LRP4内化降解和阻断LRP4和聚集蛋白/MuSK的结合，但目前仍需进一步实验证实。Zisimopoulou等[29]研究表明，LRP4-MG患者血清中LRP4-Ab阳性率均较低。该类MG患者的临床表现主要为：女性较男性多；平均发病年龄约为50岁；多数患者病情中等，以面部及延髓肌受累为主；所有患者腾喜龙试验均为阳性；均未发现胸腺瘤；93.3%的患者重复电刺激(RNS)低频衰减试验阳性；绝大部分患者单用乙酰胆碱受体酯酶抑制剂或者合并小剂量糖皮质激素治疗有效；预后较MuSK-MG患者好。故LRP4-Ab的检测对于临床辅助诊断及提供治疗方案、提示预后等方面均有重要意义。

6 肌联蛋白抗体(Titin-Ab)

肌联蛋白Titin又称连接素，是横纹肌中除粗、细肌原纤维之外的第三种结构蛋白，相对分子质量为3000 000。由27 000个氨基酸组成。它在肌纤维中起着组建、维持静止张力与拉长弹性等重要作用。Titin可分为z线部分、I带部分、A带部分和M线部分，其中I带部分生理功能最重要，主要免疫原区位于A/I带的交界处[25]。Titin-Ab是针对Titin中A/I带的交界处的主要免疫原区产生的抗体，是一种诊断伴有胸腺瘤MG，尤其是上皮细胞型胸腺瘤较为敏感、特异、简便易行的实验室抗体参数。

文献数据显示，MG患者血清中Titin-Ab的阳性率由种族、环境及检测方法不同有所不同。Szczudlik等[34]发现在年龄>60岁的迟发型合并胸腺瘤MG(MGT)患者中Titin-Ab的阳性率为54%。如Titin-Ab在早发型MG患者中检测出来可能预示其伴发胸腺瘤。而Suzuki等[35]研究数据显示：MG患者血清中Titin-Ab的阳性率为20%～40%，在迟发型合并胸腺瘤MG患者中Titin-Ab的阳性率为49%～95%，在年龄>60岁的迟发型MG 患者中Titin-Ab的阳性率为60%～80%。总之，Titin-Ab对于迟发并伴有胸腺瘤的患者诊断有较为重要的价值。

7 抗兰尼碱受体钙释放通道(RyR)抗体

RyR是一种位于肌浆网上的钙释放通道。RyR有RyR1和 RyR2两种形式。RyR是一个含有5035个氨基酸的蛋白质。RyR-Ab可以在13%～38% 的MG以及70%～80%的合并胸腺瘤MG患者血清中检测出来，男女比例相对均衡。其致病途径主要由以下几点：补体激活致病；抑制钙离子从肌浆网释放；抑制兴奋收缩耦联。该类抗体阳性MG患者的临床表现较Titin-Ab阳性的MG患者重，常常累及延髓、呼吸及颈项肌，也可伴发肌无力危象。伴发胸腺瘤的RyR-Ab阳性MG患者预后不佳[35]。现常用新型免疫抑制剂如他克莫司治疗效果尚佳，他克莫司主要发挥的就是抑制T细胞增殖，同时可抑制RyR抗体介导的钙离子释放障碍。

综上所述，MG是目前研究较为明确的涉及体液免疫及细胞免疫的自身免疫性疾病。但其发病机制较为复杂，牵涉多种免疫机制、抗体及细胞因子。相信随着各项实验技术的普及和更新，上述各项检测将进入临床辅助诊断MG，尤其是对MG的各种亚型的判断有重要意义，并为MG提供具有针对性的治疗方案及预后指导。

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(本文编辑：时秋宽)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.03.013

550004 贵阳医学院神经病学教研室(李媛)；550004 贵阳医学院附属医院神经内科(楚兰、张艺凡)

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2014-09-21)