Tspan8在结肠癌细胞中的表达及小干扰RNA干扰后对SW620细胞功能的影响

任宇鹏，宋纯，孟庆凯

（辽宁省肿瘤医院大肠外科，沈阳110042）

Tspan8在结肠癌细胞中的表达及小干扰RNA干扰后对SW620细胞功能的影响

任宇鹏，宋纯，孟庆凯

（辽宁省肿瘤医院大肠外科，沈阳110042）

目的 检测Tspan8在结肠癌细胞中的表达，采用siTspan8下调Tspan8的表达，观察其对SW620细胞转移、浸润及增殖功能的影响。方法采用Western blot和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测4种结肠癌细胞系中Tspan8蛋白和mRNA表达水平，以siTspan8对SW620细胞中Tspan8进行干扰，干扰后采用MTT及Transwell对增殖、转移及浸润进行检测。结果4种结肠癌细胞系中Tspan8在蛋白水平及mRNA水平均有表达，Western blot显示来自转移灶的人结肠癌细胞系SW620中Tspa8表达水平高于来自原发灶的Colo-205、HCT-116及HT-29，差异有统计学意义（均P＜0.05），qRT-PCR显示SW620中Tspan8mRNA表达高于Colo-205、HCT-116及HT-29，差异有统计学意义（均P＜0.05）。MTT及Transwell显示siTspan8对SW620中Tspan8进行干扰后，结肠癌细胞增殖没有改变，转移及浸润能力减弱。结论Tspan8在结肠癌细胞中有表达，下调Tspan8表达对结肠癌细胞的转移及浸润有抑制作用。

结肠癌；Tspan8；小干扰RNA；四跨膜蛋白

结肠癌是发病率较高的消化系统恶性肿瘤之一，呈年轻化及发病率逐年增高趋势，转移及浸润是结肠癌恶性行为的主要特征之一，首要转移脏器以肝脏为多，一半患者可能最终出现肝转移，约25%的结肠癌患者首诊时发现肝转移。伴有转移的结肠癌患者生存时间低于1年，因此其转移特征一直是研究的主要方向［1］。四跨膜蛋白超家族在恶性肿瘤转移及浸润中的作用受到研究者关注［2］，Tspan8是研究较深入的四跨膜蛋白超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF）成员，在胃癌、肝癌及食管癌中高表达，与肿瘤转移及复发呈正相关［3］。Tspan8可能在肿瘤的预测、诊断、预后评估方面具有重要的临床意义［4］。

本研究对结肠癌细胞株中Tspan8在蛋白及mRNA水平的表达进行了检测，并采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术对其表达进行下调，从而进一步研究其在结肠癌细胞增殖、浸润及转移中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

结肠癌细胞株Colo-205、HCT-116、SW620及HT-29购自中国中科院上海细胞库，采用常规贴壁细胞培养方法进行培养、传代及保存。

1.2 实验试剂

兔多克隆Tspan8抗体及逆转录试剂盒购自美国Biorbyt公司，膜蛋白提取试剂盒购自百仕葆北京生物医药科技有限公司，All-in-One qPCR Mix试剂盒购自美国GeneCopoeia公司，Lipofectamine LTX and PLUS购自美国Invitrogen公司。引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成。siTspan8及siControl均由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法：按说明书提取结肠癌各细胞株总蛋白，BCA定量试剂盒测定蛋白的浓度，样品均定量为5 g/L，每条泳道均上样60 μg蛋白，经12%十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压70 V条件下经80 min电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，加一抗，4℃孵育过夜。TBST洗膜，加二抗室温孵育1.5 h，TBST清洗后ECL发光，凝胶显像仪显像。

1.3.2 实时定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）法：采用RNA分离试剂盒Trizol试剂盒提取纯化各细胞株总RNA；所有RNA样本浓度均稀释至1 g/L，根据逆转录—扩增试剂盒说明书进行逆转录及扩增。RTPCR反应体系（2×All-in-One qPCR Mix 10 μL，50× Syber Green 2 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4 μL）。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸10 s，40个循环。所有反应均设立了复孔，并以DEPC水代替模板，cDNA为阴性对照。Tspan8上游引物：5′-CAGTAGCATATGCGTGTCA-3′，下游引物：5′-CCAGCTGGGCTGAGACTA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCATCGCCAAGGCTCAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGCAGACGTCAGTCGA-3′。

1.3.3 siTspan8转染：siTspan8序列为5′-CAACCUA CUUCAAUGTT-3′。将（3.0～8.0）×105细胞接种于6孔板，选择24 h内细胞融合达到70%～90%的细胞株进行转染，根据Lipofectamine LTX and PLUS试剂说明书进行转染。采用Western blot和qRT-PCR对 siTspan8组和siNegative组中的Tspan8表达进行比较，进行转染效率的检测。

1.3.4 细胞增殖检测：采用MTT检测细胞增殖，按MTT试剂盒操作，比色选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，重复3次。

1.3.5 细胞迁移能力检测：按Transwell Polycarbonate Membrane Inserts试剂盒操作步骤进行操作，在显微镜下取8个不同视野（×100）进行计数，重复3次，计算每次迁移细胞减少的百分比。

1.3.6 细胞侵袭能力检测：按BioCoat Matrigel invasion chamber试剂盒操作步骤进行操作，显微镜下取8个不同视野（×100）进行计数，重复3次，计算侵袭细胞减少百分比。

1.4 统计学方法

采用PASW Statistics 18.0软件进行作图及统计分析，计量资料采用x±s表示，率的比较采用χ2检验。Western blot法采用QuantityOne检测灰度值，与qRT-PCR结果均采用GraphPad Prism 6.0进行单因素方差分析及作图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌细胞株的Western blot检测结果

在26 kDa处有灰色条带显示，Tspan8在4组细胞株中均有表达，来自结肠癌转移灶的SW620中Tspan8蛋白表达较来自原发灶的Colo-205、HCT-116及HT-29中高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1A。

2.2 结肠癌细胞株的qRT-PCR检测

4组细胞株中Tspan8在mRNA水平均有表达，SW620中Tspan8 mRNA表达与Colo-205、HCT-116及HT-29对比，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1B。

2.3 Western blot和qRT-PCR对siTspan8转染效果的检测

Western blot显示siTspan8转染SW620细胞后，Tspan8表达条带明显淡于siControl及siTspan8，差异有统计学意义（P＜0.05）。qRT-PCR显示siTspan8转染后，SW620细胞Tspan8 mRNA表达量明显降低，沉默效率约为55%～66%，沉默效果佳，可进行进一步实验。

2.4 MTT法检测细胞增殖

MTT检测siTspan8干扰后SW620细胞株的增殖能力，通过采集0、24、48、72、120 h时间点的数据，siControl、Tspan8与siTspan8比较结果显示，siTspan8干扰对SW620细胞增殖能力的差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.5 siRNA转染后细胞迁移能力检测

Transwell显示，siTspan8转染细胞与siControl转染细胞及Tspan8细胞相比，明显降低SW620细胞的迁移能力（P＜0.05），见图3A。

2.6 siRNA转染后细胞侵袭能力检测

瞬时转染siTspan8较siControl及Tspan8组明显降低SW620细胞的侵袭能力（P＜0.05），见图3B。

3 讨论

Western blot结果显示，在蛋白水平Tspan8在结肠癌细胞株中均有表达，在来自转移灶的SW620中表达量高于来自原发灶的细胞株，Tspan8过表达可能与消化系统肿瘤转移及浸润的恶性行为相关［5，6］。qRT-PCR检测显示，来自转移灶的人胰腺腺癌细胞系的Tspan8 mRNA表达与来自原发灶的细胞系相比表达水平也较高，这与Western blot结果一致。有研究显示，Integrinα3、β1明显与CD9、CD81、CD151共位，Integrinα6β4与CD151及CO-29大部分共位，形成复合体，对结肠癌细胞运动具有促进作用［7］。Tspan8在肝癌及胃癌中过表达，与肿瘤临床分期呈正相关，与肿瘤的生存率呈负相关［8］。目前还没有Tspan8与结肠癌临床病理的相关性研究。结肠癌患者死亡原因以复发、肝转移、腹腔转移及肺转移为多，Tspan8可能与这些转移灶复发灶的形成密切相关。Herlevsen等［9］研究认为，大鼠D6.1A（Tspan8）与Integrinα6β4结合会增加恶性肿瘤细胞运动性，对肝转移灶形成有促进作用。转移可能因D6.1A/ Integrin β4β4形成共位复合体，从黏附支持因子转为转移支持因子，增强了肿瘤细胞转移及浸润能力。有研究认为，二甲双胍对结肠癌细胞的恶性行为可能有抑制作用，可能通过作用于细胞膜蛋白实现［10］。

本研究采用siRNA技术对SW620结肠癌细胞中Tspan8进行了成功的转染下调，干扰效率满意，干扰后SW620细胞增殖能力没有改变，转移及浸润能力下降。这说明，作为细胞膜蛋白，Tspan8对细胞的增殖能力没有影响，Tspan8在恶性肿瘤细胞生长、分裂中不起到主要作用，Tspan8下调后结肠癌细胞的转移及浸润能力明显下降，Tspan8可能参与结肠癌细胞的运动，过表达会增加恶性肿瘤细胞的转移活性，并增加其浸润能力。

也有研究认为，Tspan8可能启动肿瘤新生血管形成［11］，并与Notch、c-Met、Rhokinase等信号通路具有相关性［12，13］，但需要进一步实验证明。本研究提示，Tspan8可以作为膜蛋白标志物，也可用于确定来源于不同细胞的间质干细胞，是干细胞治疗的可能策略之一［14］。Tspan8为靶向的siRNA，是治疗结肠癌可能策略之一。对于四跨膜蛋白超家族的进一步研究，具有更深远的意义。

［1］Haining EJ，Yang J，Bailey RL，et al.The TspanC8 subgroup of tetraspanins interacts with A disintegrin and metalloprotease 10（Adam10）and regulates its maturation and cell surface expression［J］. J Biol Chem，2012，287（47）：39753-39765.

［2］Berthier-Vergnes O，Kharbili ME，de la Fouchardière A，et al.Gene expression profiles of human melanoma cells with different invasive potential reveal TSPAN8 as a novel mediator of invasion［J］.Br J Cancer，2011，104（1）：155-165.

［3］Richardson MM，Jennings LK，Zhang XA.Tetraspanins and tumor progression［J］.Clin Exp Metastasis，2011，28（3）：261-270.

［4］Yue S，Mu W，Zöller M.Tspan8 and CD151 promote metastasis by distinct mechanisms［J］.Eur J Cancer，2013，49（13）：2934-2948.

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［10］朱智峰，梁琳琅.二甲双胍对结肠癌细胞增殖、周期及凋亡的影响［J］.中国医科大学学报，2012，41（2）：121-125.

［11］Zhang M，Cui F，Lu S，et al.Increased expression of prothymosinα，independently or combined with TP53，correlates with poor prognosis in colorectal cancer［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（8）：4867-4876.

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［13］葛鑫，刘兵，陈允梓.小干扰RNA沉默维生素D受体对结肠癌细胞转移的影响［J］.中国医科大学学报，2013，42（12）：23-29.

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（编辑 陈 姜）

Expression of Tspan8 in Colon Cancer Cell Lines and Effects of siRNA-mediated Tspan8 Gene Silencing on the Cell Function of SW620

REN Yu-peng，SONG Chun，MENG Qing-kai
（Department of Colorectal Surgery，Liaoning Cancer Hospital and Institute，Shenyang 110042，China）

ObjectiveTo evaluate the expression of Tspan8 in colon cancer cell lines and investigate the effect of siTspan8 on the proliferation，invasion and migration of SW620 cells.MethodsWestern blot and quantitative real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）were used to detect the protein and mRNA expression in 4 different colon cancer cell lines.siTspan8 was use to knockdown the expression of Tspan8 in SW620 cell. MTT and Transwell assay were used to detect the proliferation，invasion and migration of siTspan8 interfered SW620 cells.ResultsTspan8 which detected by Western blot and qRT-PCR in all four colon cancer cell lines.Western blot and qRT-PCR showed that Tspan8 expressions were higher in SW620，which derived from metastasis colon cancer，than in Colo-205，HCT-116 and HT-29 cell lines，which derived from primary tumor.MTT and Transwell showed that the proliferation has not been changed，the invasion and migration were inhibited after Tspan8 was inferred with siTspan8.ConclusionTspan8 was expressed in colon cancer cells and downregulation of Tspan8 expression may inhibit the invasion and metastasis of colon cancer cells.

colon cancer；Tspan8；small interfering RNA；tetraspanin

R735.3

A

0258-4646（2015）01-0034-04

辽宁省自然科学基金（2014020102）

任宇鹏（1978-），男，主治医师，博士. E-mail：pangheshangmomo@163.com

2014-10-13

网络出版时间：