蝎黄解痉治哮颗粒对哮喘小鼠模型中p38MAPK和Th1/Th2类细胞因子变化的影响

冯晓纯， 段晓征， 朱浩宇， 延光海， 郑美珠

蝎黄解痉治哮颗粒对哮喘小鼠模型中p38MAPK和Th1/Th2类细胞因子变化的影响

冯晓纯， 段晓征， 朱浩宇， 延光海， 郑美珠

目的 探讨蝎黄解痉治哮颗粒对哮喘小鼠气道炎症和Th1/Th2类细胞因子变化的影响及其可能机制。方法 将24只6～8周龄雄性小鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、小剂量中药组、大剂量中药组，每组6只。制备支气管哮喘模型，小剂量中药组、大剂量中药组分别给予蝎黄解痉治哮颗粒免煎制剂每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混匀溶液灌胃每日2次，连续10 d；正常对照组和哮喘模型组小鼠给予等量生理盐水。分别采用酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞介素4(IL-4)、IL-5、γ干扰素(IFN-γ)含量以及肺组织中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)的变化，并观察BALF中炎症细胞和肺组织病理学改变。结果 哮喘模型组小鼠BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5含量水平升高和IFN-γ水平降低；肺组织中磷酸化p38MAPK表达水平升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。小、大剂量中药组小鼠BALF中炎症细胞计数、IL-4、IL-5含量水平下降和IFN-γ水平升高；肺组织中磷酸化p38MAPK表达水平降低，与哮喘模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。小、大剂量中药组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 p38MAPK可能参与了支气管哮喘的发病过程。蝎黄解痉治哮颗粒对哮喘小鼠具有保护作用，其机制可能与抑制p38MAPK磷酸化、调节Th1/Th2平衡失调、减轻炎症细胞浸润有关。

哮喘； 蝎黄解痉治哮颗粒； p38MAPK； Th1/Th2细胞因子； 小鼠； 动物，实验

哮喘是一种病因尚不明确的复杂性疾病。在气道炎症发生中，T淋巴细胞占有主导地位[1]。在其复杂的发病机制中，对于辅助性Th1/Th2比例失衡会诱发哮喘发作的有关研究最为多见。Mosmann等[2]于1986年研究发觉小鼠CD4+T细胞以因子出现的模式及生理功效分为：以释放白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)和γ干扰素(interferon，IFN-γ)为主的视作Th1细胞亚群，参与细胞免疫应答；以释放IL-4、IL-5为主的视作Th2细胞亚群，参与体液免疫应答。有研究证实，Thl/Th2类细胞之间失去平衡是诱发哮喘发作的主要因素之一[3]。p38MAPK作为细胞内重要的信息传导者之一，参与了多种生理过程的调节，如发病机制、炎症、细胞凋亡等作用尤为显著，p38MAPK或许在哮喘的发病机制中扮演重要的角色[4]。而且，多种研究结果表明，p38MAPK通过作用于其下游各转录因子对IL-4等Th2类细胞分泌的炎症因子进行的调节[5-6]。本研究通过观察各哮喘小鼠BALF中的炎症细胞总数、分类及计数、肺组织病理学变化和肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达情况，分析蝎黄解痉治哮颗粒对它们的影响，为进一步明确哮喘的发病机制和蝎黄解痉治哮颗粒的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄清洁级BALB/C雄性小鼠24只，体质量(18±5)g，由延边大学医学部实验动物中心提供(合格证号：SCXK(吉)2011-0007)。24只小鼠按随机数字表法分为正常对照组、哮喘模型组、小剂量中药组、大剂量中药组4个组，每组6只。

1.2 药品与试剂 卵清白蛋白、氢氧化铝凝胶(Sigma公司)，Diff-Quick染液(碧云天生物技术研究所)，mIL-4、mIL-5检测试剂盒(深圳市达科生物技术公司)，IFN-γ检测试剂盒(上海基免实业有限公司)，p-p38多克隆抗体(Mybiosource公司)。XW-502B型超声雾化器(上海寰熙医疗器械有限公司)，RT-2100C酶联免疫检测仪(Sigma公司)；E-C电泳仪及电泳槽(美国A-C公司)；EV243电泳仪(英国柏楉)；Westernblot转膜仪(BioRad公司)。

1.3 蝎黄解痉治哮颗粒药品配制 蝎黄解痉治哮颗粒(麻黄、杏仁、苦参、白果、全蝎、甘草)由江阴天江药业有限公司制备。小剂量按小鼠体质量14.9 g/kg，大剂量按小鼠体质量59.8 g/kg。

1.4 哮喘模型的建立 依据相关文献[7]中记载的方法，除正常对照组外将其他组中每只小鼠腹腔注入溶于磷酸盐缓冲液的10 μg卵清白蛋白及氢氧化铝混合液0.5 mL处于致敏状态。第21天开始每日同一时间持续3 d对小鼠施以激发实验，使小鼠行雾化吸入，每次30 min。

1.5 给药 实验第17天开始连续给药10 d，小、大剂量中药组均定量定时给予蝎黄解痉治哮颗粒免煎制剂每日0.72、2.89 g，按20 mL/kg配制成水混匀溶液灌胃每日2次，连续10 d；正常对照组和哮喘模型组小鼠给予等量生理盐水。

1.6 实验样本的制备 用无水乙醚处死小鼠后，切开小鼠的颈部皮肤，使气管暴露，行气管插管，1 mL注射器向气管内分3次缓慢注入磷酸盐缓冲液(1 mL氯化钠)，缓慢的抽吸回收支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，将灌洗液收集入EP管中，暂放置于冰中冻存，并配平以3 000 r/min，离心5 min，留上清液400～600 μL于-80 ℃冻存待用。打开胸腔的同时分离双肺，并提取左肺肺门中下段及左肺下叶，用生理盐水冲洗，先后将提取的标本放置于-80 ℃冰箱中冻存备用，使用10%甲醛固定液以4 ℃为标准将其储存待用。

1.7 BALF中炎症细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的检测 载玻片上涂抹的血液细胞和BALF的细胞用Diff-quik染色。取出染色后冷藏于-80 ℃冰箱中的BALF，在室温内平衡20～30 min，应用ELISA Kit检测上清液中IL-4、IL-5、IFN-γ细胞因子的含量。

1.8 肺组织磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表达的检测 分别实行肺组织细胞核及肺组织细胞浆提取、蛋白含量测定、采用Western Blot检测方法使磷酸化p38MAPK SDS-PAGE电泳、转膜、封闭、加一抗、二抗实行免疫反应、化学发光、显影、定影，最后凝胶图像分析。

2 结果

2.1 各组小鼠BALF中的炎症细胞总数、分类及计数的变化 见表1。

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与哮喘模型组比较，bP<0.05；与小剂量中药组比较，cP<0.05。

表1结果表明，哮喘模型组及小、大剂量中药组嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、炎症细胞总数均显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。小、大剂量中药组嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、炎症细胞总数均显著低于哮喘模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。大剂量中药组在降低嗜酸性粒细胞计数、淋巴细胞计数、炎症细胞总数水平上与小剂量中药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组小鼠BALF中炎症细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ含量的变化 见表2。

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与哮喘模型组比较，bP<0.05；与小剂量中药组比较，cP<0.05。

表2结果表明，哮喘模型组及小、大剂量中药组BALF中细胞因子IL-4、IL-5含量较正常对照组均显著增多，IFN-γ含量显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；小、大剂量中药组IL-4、IL-5的含量较哮喘模型组减少，IFN-γ含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。大剂量中药组在降低小鼠BALF中细胞因子IL-4、IL-5的含量、升高IFN-γ含量的水平上与小剂量中药组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组小鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白表达的变化 见图1。

经Western blot法检测各组小鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达水平，见表3。

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与哮喘模型组比较，bP<0.05；与小剂量中药组比较，cP<0.05。

表3结果表明，哮喘模型组及小、大剂量中药组小鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。小、大剂量中药组小鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达水平低于哮喘模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。大剂量中药组小鼠肺组织磷酸化p38MAPK蛋白的表达水平低于小剂量中药组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

支气管哮喘是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、气道上皮细胞等)及其组分共同作用于气道诱发慢性炎性反应[8]。Th1主要分泌IFN-γ及IL-2等细胞因子，与细胞免疫调节有关；Th2主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等炎性因子，使B淋巴细胞产生IgE，其与各种炎症细胞如肥大细胞、嗜碱性粒细胞相结合，从而介导体液免疫，最终引起变态反应。当机体处于正常时，Th1/Th2处于相对平衡状态，当机体受到异常刺激时，会导致Th1/Th2比例失衡，即Th1产生的IL-2、IFN-γ等因子含量减少，主要以IFN-γ含量减少为主；Th2产生的IL-4、IL-5及IL-13等因子含量增加，主要以IL-4、IL-5含量增多为主。其中IFN-γ可诱发Th1的分化，抑制Th2的增殖，使Th2更少的分泌炎症因子，但当两者失衡时，IFN-γ含量减少，Th2分泌的炎症因子相对增加，促使IgE生成，介导体液免疫反应，诱发哮喘发生。可见，在哮喘发生中，存在Th2类细胞因子的过分活跃，是诱发哮喘发生的重要因素。

p38MAPK通路是细胞内重要的信号通路，涉及哮喘气道慢性炎症、气道高反应性以及气道重构等多个方面[9-10]。p38MAPK通路是MAPK家族信号转导通路之一，主要对多种炎症细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行转导。p38MAPK通路能够对细胞内氧化过程酶类表达起调控作用，诱导黏附蛋白的表达，调节免疫系统细胞的分化和增殖过程。研究证实，各种炎性介质的分泌及发挥均依靠磷酸化p38MAPK信息传递途径。有研究已证明p38MAPK 的激活，不仅能促进单核巨噬细胞产生白细胞介素(IL-1、IL-4、IL-6、IL-8)等炎性因子，还可以介导中性粒细胞的活化。应用p38MAPK抑制剂能够显著抵制中性粒细胞趋化性和超氧化物产生、减轻炎症反应，P38MAPK通过对转录因子的磷酸化来调控Th2类细胞因子的表达[10]。本研究结果显示，经蝎黄解痉治哮颗粒治疗后，与哮喘模型组相比，小、大剂量中药组小鼠炎症细胞计数及总数、IL-4及IL-5含量和肺组织中磷酸化p38MAPK蛋白的表达均较下降，IFN-γ含量升高，提示蝎黄解痉治哮颗粒对哮喘小鼠磷酸化p38MAPK蛋白表达有明显的抑制作用，对Th1/Th2类细胞因子平衡有正向调节作用，可减少炎症细胞的浸润。其对哮喘小鼠的保护作用可能与此作用密切相关。同时，虽然经蝎黄解痉治哮颗粒大、小剂量中药组干预后的哮喘小鼠BALF中炎症细胞计数及总数、嗜酸性粒细胞的分泌、上皮细胞的改变、IL-4及IL-5含量的改变和肺组织中磷酸化p38MAPK蛋白的表达情况均较哮喘模型组有所显著下降，但与正常对照组比较仍相对升高，提示可能存在没有被蝎黄解痉治哮颗粒干预到的有某些其他机制也参与了哮喘的病变过程。因此，更深入的探索蝎黄解痉治哮颗粒的作用机制，使其得以全面的诠释并应用于临床意义重大。

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(本文编辑：刘颖)

Effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on p38MAPK and Th1/Th2 cytokines in a mouse model of asthma

FENGXiaochun，DUANXiaozheng，ZHUHaoyu，YANGuanghai，ZHENGMeizhu.

DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofChangchunUniversityofTraditionalChineseMedicine，Changchun130021，China.

Objective To explore the effect of scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma on airway inflammation in asthmatic mice and Th1/Th2 type cytokines changes and its possible mechanism.Methods Totally 24 male mice of only 6 to 8 weeks old were randomly divided into four groups:normal control group, asthma model group, small-dose traditional Chinese medicine group, large-dose Chinese medicine group, 6 mice in each group. Make bronchial asthma model, and the samll-dose traditional Chinese medicine group and large-dose TCM group were given scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma to let boiled preparation, 0.72 and 2.89 g daily to make 20 mL/kg aqueous mix solution for stomach irrigation twice a day, for 10 days; normal control group and the asthma model group were given the equal amount of saline. Enzyme linked immune sorbent assay and immunoblotting were used to detect leukocyte mediated-4(IL-4), IL-5, interferon gamma(IFN-γ) content in bronchial alveolar irrigation lavage fluid (BALF) and phosphorylated p38 mitogen activated protein kinase(p38MAPK) changes in the lung tissue, and the pathological changes of inflammatory cells in BALF and lung tissue were observed.Results In BALF of asthmatic model group,inflammatory cell count, IL-4 and IL-5 levels increased and IFN-γlevels decreased; in lung tissues phosphorylated p38MAPK expression level increased, and compared with the normal control group, the difference was statistically significant(P<0.05). The inflammatory cell counts, IL-4 and IL-5 levels decreased and IFN-γ levels increased, in BALF of large-dose Chinese medicine group increased; in lung tissues the phosphorylated p38MAPK expression level reduced, and compared with the asthma model group, the differences were statistically significant(P<0.05). Comparing small with large-dose TCM group, the difference was not statistically significant(P>0.05). Conclusion p38MAPK may be involved in the pathogenesis of bronchial asthma. Scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma has a protective effect on asthma in mice, and the mechanism may be related to inhibiting p38MAPK phosphorylation, regulating the imbalance of Th1/Th2 cells and reducing the inflammatory cell infiltration.

asthma; scorpion ephedra antispasmodic granules for asthma; p38MAPK; Th1/Th2 cytokine; mouse； animal, experiment

吉林省科技发展计划项目(20130102068JC)

130021 长春，长春中医药大学附属医院儿科(冯晓纯，段晓征，朱浩宇)；133002 吉林 延吉，延边大学医学院解剖教研室(延光海)；130021 长春，长春中医药大学研究生院(郑美珠)

冯晓纯(1960-)，女，医学硕士，教授、主任医师，博士研究生导师。研究方向：小儿肺系疾病的中西医结合治疗。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.04.007

R-33

A

1674-3865(2015)04-0316-04

2015-04-10)