MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响

黄 艳，易阳艳

（南昌大学第二附属医院医疗美容科江西南昌330006）

·基础研究·

MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响

黄 艳，易阳艳

（南昌大学第二附属医院医疗美容科江西南昌330006）

目的：检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响。方法：体外培养人脂肪源干细胞，取第三代细胞接种到96孔板，以不同浓度（纤维蛋白与凝血酶比例：4∶1、2∶1、8∶3、5∶2）的纤维蛋白胶浸润提取液培养，用MTT法检测脂肪源干细胞在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。结果：不同浓度纤维蛋白胶制备的浸泡提取液所培养的人脂肪源干细胞的生长曲线无明显差异。结论：不同浓度纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞的增殖无明显影响，纤维蛋白胶有望成为人脂肪源干细胞生长的支架材料。

纤维蛋白胶；人脂肪源干细胞；MTT法；组织工程

纤维蛋白胶（fibrin glue，FG）是一种可降解、无毒的生物蛋白制剂。对于组织工程基质材料的选择，目前所采用的可注射性材料有纤维蛋白胶、聚乙烯类水凝胶、聚乙烯醇-壳聚糖水凝胶、藻酸盐类、琼脂糖类、透明质酸类、壳聚糖衍生物类等［1］。纤维蛋白胶因其良好的生物相容性，并能促进细胞如干细胞的黏附与增殖，被用作多种药物、细胞及细胞因子的缓释载体［2-4］。脂肪源干细胞具有来源广泛、取材不涉及伦理问题、对患者创伤小、细胞获得量大、无排斥反应等优点，并具有多向分化的潜能［5］，是理想的组织工程种子细胞。本实验主要探讨纤维蛋白胶作为支架对于人脂肪源干细胞（human adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）增殖的影响，为人脂肪源干细胞作为种子细胞、纤维蛋白胶作为支架材料的组织构建研究奠定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基（含青、链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（Gibco公司，美国）、Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国）、MTT液、二甲基亚砜（DMSO）、纤维蛋白原（Sigma公司，美国）、凝血酶（Sigma公司，美国）。

1.2 脂肪源干细胞的分离、扩增

1.2.1 脂肪源干细胞的分离与培养：取脂肪抽吸术后的脂肪组织，组织来源于20～40岁女性患者，排除自身免疫性疾病、遗传病及其他恶性疾病，患者知情同意。注射器负压吸引法吸取脂肪组织20ml，PBS冲洗，去除肉眼可见的血管和纤维结缔组织，无菌镊子、剪刀剪碎脂肪；将处理好的组织移入50ml离心管，加入等体积0.075%Ⅰ型胶原酶于37℃条件下消化2h，期间不时振荡，使脂肪与酶充分接触；加入含15%胎牛血清的高糖培养基终止消化；1 500rpm，5min；弃去漂浮的脂肪组织和上清，完全培养基制成细胞悬液；接种在10mm培养皿中，在37℃、5%CO2孵箱内培养，24h后观察细胞贴壁状态，进行第一次换液，弃原培养基和漂浮细胞，连续培养，2～3d换液。

1.2.2 脂肪源干细胞的扩增：待单层细胞融合率达到80%～90%时，用PBS清洗2次，加入1:250胰蛋白酶（含EDTA）消化，当细胞变圆并部分脱落时，加入含15%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养区域；收集细胞悬液，以1∶2～3比例传代，2～3d换液；传至第3代备用。

1.3 支架材料的制备

纤维蛋白胶及其浸润提取液的制备：纤维蛋白原、凝血酶按不同比例混合（浓度4:1、浓度2:1、浓度8:3、浓度5:2），制成不同浓度的纤维蛋白胶。分别接种于96孔板中，每组各设6孔，1个主孔，5个副孔，共4组。待形成具有固定强度的纤维蛋白胶后加入150μl DMEM培养液，放入37℃、5%CO2孵箱内静置48h制备不同浓度纤维蛋白胶的浸润提取液待用。

浸润提取液培养细胞：将第3代人脂肪源干细胞制成1×103/150μl细胞密度接种于96孔板中，每孔加入150μl细胞悬液。每组各设6孔，1个主孔，5个副孔，共4组，另设一组用常规培养基培养作为对照组。放入37℃、5%CO2孵箱内24h，待细胞贴壁；弃原培养基，PBS清洗2遍，第一组加入纤凝比为4:1的浸润提取液，第二组加入纤凝比为2:1的浸润提取液，第三组加入纤凝比为8:3的浸润提取液，第四组加入纤凝比为5:2的浸润提取液，另设一组用常规培养基培养的细胞作为对照组，隔天换液。重复两次，结果行多样本χ2检验。

1.4 检测方法

培养2、4、6、8、10d后，各孔加入5mg/mL MTT液体15μl，继续培养4h。然后取出培养板，吸去孔内培养液，加入150μl DMSO，酶联免疫检测仪自动振摇培养板1min，以490nm为参考波长测定吸光度值（OD值）。

2 结果

通过酶联免疫检测仪测定的OD值进行绘图，以培养天数为横轴，OD值为纵轴，绘制生长曲线。如图（图2）可见：实验组和对照组在2d内增殖均不明显，2d后缓慢增殖，各浓度均在第6天达生长高峰，之后出现生长抑制，以浓度3、4更为明显。各浓度在第2天开始出现对数生长，至第6天达生长高峰。用Excel统计软件包对实验结果进行χ2检验，P＞0.05，四种浓度的实验各组和对照组之间细胞增殖无明显差异。

3 讨论

在组织工程研究中，寻找充分发挥组织再生潜力的细胞外基质材料是核心内容。它要求支架具有三维立体结构，并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。可注射性支架是将细胞与一种具有流动性的、生物相容性好的材料复合，直接通过注射器注射到机体缺损部位，具有原位成形、操作简单、塑形随意、创伤小、不需要手术、可以减少患者痛苦与风险等优点，越来越受到人们的关注［6］。

在本实验中，笔者观察到纤维蛋白胶由纤维蛋白原和凝血酶混合构成胶体状，可随盛放容器的形状而任意改变。Wu Han［7］等人实验表明凝血酶所占比例越高，胶体强度越大，骨髓基质细胞在低强度（浓度4:1、浓度2:1）的纤维蛋白胶中细胞繁殖良好，而在高强度（浓度8:3、浓度5:2）的纤维蛋白胶中细胞逐渐死亡。在本实验中笔者得到了基本相同的结果，细胞在不同浓度的浸提液中均在第2天开始呈对数生长，第6天达生长高峰，之后出现生长抑制，但高强度（浓度8:3、浓度5:2）浸润提取液中的细胞比低强度（浓度4:1、浓度2:1）浸润提取液中细胞抑制更加明显。实验中笔者采用了两个相近浓度制备胶体，意在说明即便存在很小浓度差的纤维蛋白胶所提取的浸润提取液培养脂肪源干细胞，细胞的生长状态仍有所不同，但大体上一致，并无明显差异。

纤维蛋白胶作为天然生物材料具有人工材料所不具备的优点，如生物相容性好、可降解、能促进细胞包括干细胞的黏附与增殖［8］，它是由血浆中纤维蛋白原在凝血酶作用下降解为纤维蛋白并聚合成不溶性的网状结构，它所形成的网状结构给脂肪干细胞提供了充分的生长空间及生长环境；它有良好的介导细胞信号传导以及细胞间相互作用的功能，能刺激脂肪干细胞迁移和黏附；它良好的组织相容性和生物降解性为本实验提供了丰富的靶细胞环境和理想的微环境；它的可塑性和良好的材料一细胞界面，是我们选择用纤维蛋白胶作为支架材料的重要因素。脂肪源干细胞具有体内分布广，取材创伤小，细胞获得量大等特点，已经成为新的研究热点。选择脂肪源干细胞做为本实验的种子细胞是因为它具备理想的种子细胞的特点：①取材方便，对机体影响小；②体外培养简便、增殖能力强；③能够向特定的组织方向发育、分化；④能够连续传代，且传代培养后不发生形态、功能的改变［9-10］。

本实验仅为初步观察，采用脂肪源干细胞在纤维蛋白胶表面生长、增殖的二维培养方法，但这种方法仅仅适用于研究细胞在体外条件下的生物学功能。下一步研究中，笔者将进行脂肪源干细胞在纤维蛋白胶中三维培养的形态学观察及生物学功能测定，并完善动物实验。另外仍会继续探索如何在短时间内获得大量纯化的自体脂肪源干细胞，加大局部脂肪源干细胞的密度，增进脂肪源干细胞的扩增。实验可见，在不同浓度的纤维蛋白胶中脂肪源干细胞增殖良好，细胞存活率可，为可注射性的纤维蛋白胶携带脂肪源干细胞移植奠定了实验基础，并为临床应用提供了理论依据。

［1］Catelas I，Sese N，Wu BM，et al.Human mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation in fibrin gels in vitro［J］.Tissue Eng，2006，12（8）:2385-2396.

［2］Christman KL，Fok HH，Sievers RE，et al.Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial in faction［J］.Tissue Eng，2004，10（3-4）:403-409.

［3］Ryu JH，Kim IK，Cho SW，et al.Implantation of bone marrow mononuclear cells using injectable fibrinmatrix enhances neovascularization in infracted myocardium［J］.Biomaterials，2005，26（3）:319-326.

［4］Catelas I，Dwyer JF，Helgerson S.Controlled release of bioactive transforming growth factor beta-1 from fibrin gels in vitro［J］.Tissue Eng Part C，2008，14（2）:119-128.

［5］杨佩，黄欣，王春生，等.预分化脂肪干细胞与纤维蛋白胶和磷酸钙骨水泥自体异位构建血管化移植物［J］.中国组织工程研究，2013，17（51）:8801-8808.

［6］张云松，高建华，鲁峰，等.人脂肪来源干细胞复合纤维蛋白胶构建可注射型工程化脂肪组织的实验研究［J］.中华医学杂志，2008，88（38）:2705-2709.

［7］Wu Han，Zhang Chun-Qiu，et al.Fibrin glue，a threedimensional scaffold for rabbit bone marrow stromal cells cultured in vitro［J］.Tissue Eng Res，2009，13（21）：4089-4092.

［8］陈红丽，吕洁丽，南文滨，等.胶原/纤维蛋白胶/载BSA微球复合支架的制备及体外性能研究［J］.中国生物医学工程学报，2014，33（1）:79-85.

［9］徐巧瑜，伍津津.人脂肪干细胞体外研究及应用进展［J］.中国美容医学，2012，21（7）:1265-1268.

［10］刘乃军，黄金井.脂肪干细胞辅助自体颗粒脂肪移植术研究进展［J］.中国美容医学，2012，21（8）:1451-1454.

MTT assay for the influence of fibrin glue on human adipose-derived stem cells proliferation

HUANG Yan，YI Yang-yan
（Department of Plastic and Cosmetic Surgery，The Second Afflicated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330000，Jiangxi，China）

Objective To examine whether the fibrin glue affects human adipose tissue-derived stem cells proliferation.Methods Human adipose tissue-derived stem cells were cultured in vitro to passage three and seeded on 96-well plate，cultured with fibrin glue in different concentration（fibrinogen/thrombin:4:1，2:1，8:3，5:2），then examine the effects on human adipose tissue-derived stem cells proliferation in different concentration by MTT assay.Results Fibrin glue in different concentration were no difference among cell growth curves of human adipose tissue-derived stem cells proliferation.Conclusion Fibrin glue in different concentration does not affect human adipose tissue-derived stem cells proliferation and may be a suitable materials as a scaffold composite with human adipose tissue-derived stem cells.

fibrin glue；human adipose tissue-derived stem cells；MTT assay；tissue engineering

R318

A

1008-6455（2015）05-0037-03

2015-01-16

2015-03-09

编辑/张惠娟

易阳艳，女，教授，主任医师，科主任，E-mail:yyy0218@126.com