诱导多能干细胞成软骨方向分化的研究进展*

郑育亮 张志光

1. 软骨的组织结构特点

软骨的主要功能是给运动关节提供减震和润滑作用。分布于人体内的软骨可分为：纤维软骨、弹性软骨和透明软骨三种类型。颞下颌关节髁突软骨属于纤维软骨。从关节表面向下，软骨可分五层：①纤维层：成纤维样细胞包裹在富含Ⅰ型胶原的纤维基质中；②增殖层：细胞呈多形性，包含软骨祖细胞；③成熟层：细胞扁平，能够分泌不含Ⅱ型胶原的前软骨基质；④前肥大层：细胞呈典型的软骨细胞样，活跃分泌Ⅱ型胶原并将其沉积在软骨基质中；⑤肥大层：由终末分化的扩张软骨细胞构成，软骨基质矿化。软骨内无血管神经分布，故软骨的损伤难以自我修复。

2. 造成软骨损伤的原因

常见的造成软骨损伤的原因主要由以下两个原因造成:

2.1 外伤造成的软骨损伤 软骨由于其自身的修复能力很弱，在受到外来因素的损伤后，常常难以自我修复。浅表性的软骨损伤，常常会发展成软骨下层的损伤。此时，位于软骨下层的骨髓间充质干细胞会迅速迁徙到损伤处，发挥自我修复损伤的功能，但是，损伤后修复的组织在机械性能，耐摩擦性能上均比原先正常的软骨组织差很多[1]，在活动频繁的关节运动中会逐渐磨损、降解，最后导致损伤区骨质破坏，形成骨关节病(Osteoarthritis，OA)。

2.2 关节软骨退化造成的软骨损伤 随着年龄的增长，关节在日常生活中常常处于负重状态，尤其是一些不良习惯造成的关节非正常负重，是造成承重关节软骨损伤、退行性病变的主要原因。

3. 软骨损伤缺损后的治疗

由于软骨特异的组织结构，目前还无特效药物可以治疗各种原因导致的软骨损伤。而传统的外科手术方法又难以达到令人满意的治疗效果。关节软骨下层存在着骨髓细胞以及骨髓间充质祖细胞，当软骨损坏缺损到达软骨下层后，受到刺激的骨间充质祖细胞会迅速作出反应，聚集到病变位置，修复病变位置的骨质缺损。正是基于这个理论，德国医生Steadman 在此基础上发明了微骨折技术(Microfracture techniques)[2]，该技术是目前在治疗软骨损伤和缺损上经常用到的外科手术技术。但是这种修复还是存在一定的缺陷，由于修复的组织主要以富含I 型胶原纤维的纤维软骨为主，机械性能差，耐摩擦能力差，在短期内可恢复病变关节的部分功能，但是长期效果不理想[1]。其他的治疗方法，例如自体软骨移植和同种异体软骨移植，虽然也可在一定程度上修复关节的骨质缺损，但是由于存在第二供区的损伤，在临床上的使用受到一定的限制，难以广泛开展应用。iPS 细胞的出现，为软骨损伤和缺损的治疗提供了新的途径。

4. 体细胞重编程及iPS 细胞的发现

哺乳动物自受精卵开始发育到成熟个体的过程，也是全能、多能干细胞逐渐分化为成体细胞的过程，一直以来，这一过程被认为是不可逆的，直到体细胞核移植技术的出现，人们才意识到，个体发育的这个过程，在一定条件下也是可以被逆转的。上世纪60 年代初，英国科学家John Gurdon利用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技术，将非洲爪蟾的体细胞核移植到卵细胞中，该细胞经过发育最终得到了一只完整的个体[3，4]。1997 年，科学家Ian Wilmut 和他的研究团队利用类似的体细胞核移植技术，实现了在哺乳动物体细胞的“克隆”[5]，克隆羊“dolly”由此诞生。2012 年，首次将该技术应用到了灵长类动物的美国科学家Shoukhrat Mitalipov 利用SCNT 技术得到了恒河猴的ESCs。2013 年，他们利用该技术获得了人胚胎干细胞[6]。SCNT 技术使科学家们意识到，成熟的体细胞在一定的条件下，是可以被重编程回到多能性状态的。随之科学家们发现另一种技术，细胞融合(cell fusion)技术也可以实现这一逆转过程。1997 年，Masako Tada 等[7]利用细胞融合(cell fusion)技术将体细胞与胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells，EG)融合之后，发现细胞内发生一系列的表观遗传学变化，一些已经沉默的基因又重性被激活表达了。但是，由于涉及胚胎干细胞的研究，避免不了要面对伦理道德宗教信仰方面的阻碍，直到2006 年，日本科学家Shinya Yamanaka 带领他的研究团队，改变了这一现状。他们通过将Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 这四个转录因子转入小鼠体细胞后，得到一类形态和功能类似于胚胎干细胞的多能干细胞，称之为诱导多能干 细 胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)[8]。2007 年，Yamanaka 和Junying Yu 同时发表论文，利用同样的方法将人的皮肤细胞重编程回到多能性状态，不过Junying Yu 使用的转录因子是Oct4、Sox2、Nanog 和Lin28，与Yamanaka 的四个转录因子中有两个不相同[9，10]。长久以来，胚胎干细胞的研究饱受其细胞来源、伦理道德及宗教信仰的困扰，体细胞重编程技术的出现，不仅仅解决了这一困扰科学界多年的问题，也为再生医学、疾病模型及药物筛选等研究领域开辟了新的途径，因此，日本科学家Shinya Yamanaka 与英国科学家John Gurdon 共同分享了2012 年的诺贝尔生理学或医学奖。

5. 诱导多能干细胞(iPSCs 细胞)或胚胎干细胞(ESCs)诱导分化为软骨细胞的策略

将iPSCs/ ESCs 扩增培养后，注射至免疫缺陷小鼠皮下，8-12 周后可以在体内形成畸胎瘤，显微镜下可以观察到畸胎瘤内有软骨岛形成，这不仅是鉴定诱导所得的iPS 细胞是否具有多能性的金标准，也从侧面证明了iPS 细胞具有形成软骨的能力。目前，对于iPSCs/ ESCs 定向向软骨或软骨细胞分化的研究有很多[11-14]，概括起来大致可分为以下四种方法，这四种方法各有优劣。(1)将iPS细胞与软骨细胞共培养，软骨细胞分泌的细胞因子可以促进iPS 细胞向软骨细胞分化，但是这种方法得到的软骨细胞数量比较少，完全依赖于共培养体系下原始软骨细胞分泌的细胞因子量。(2)让iPS细胞先在体外形成拟胚体(Embryoid bodies， EB)后，再选取拟胚体中的中胚层成分进行软骨或软骨细胞诱导，这种方法的缺点是其所能得到的可诱导软骨或软骨细胞的中胚层细胞较少，难以满足组织工程技术所需要的细胞量。(3)将iPS 细胞向间充质干细胞样细胞(Mesenchymal stem cell-like cells，MSC-like cells)诱导分化，再进一步将所得到的MSC-like cells 向软骨或软骨细胞诱导，这种方法的缺点在于如何高效获取能发挥良好分化功能的MSC-like 细胞。(4)模拟软骨细胞发育过程，经历原始中内胚层、中胚层和软骨诱导三个阶段，分别在每一阶段给予含相应的细胞因子培养基诱导，最终得到SOX-9 表达阳性的软骨细胞[15]。尽管已有上述的众多实验证明iPSCs 可以向软骨或者软骨细胞分化，表达软骨细胞的特异性表面标志，但是，迄今为止，还无学者发表论文证实由iPSCs 诱导所得的软骨细胞可以生成具备一定机械性能的软骨。而于1998 年和2001 年，学者Johnstone 和Barry[16，17]就曾发表论文称通过一定的诱导手段，BMSCs 可以诱导为真正意义上的软骨。究竟iPSCs 是否可以像BMSCs 一样，制备出真正意义上的具备一定机械性能、可承受一定压力的软骨组织，就目前的研究而言，还不足以让我们下结论，还需要进一步的深入研究来证实。

6. 诱导多能干细胞(iPSCs)向软骨细胞定向分化的主要影响因素

iPSCs 的定向分化是目前的研究难点和热点。既往的研究多数集中于血液、神经和肝细胞等的分化，而利用iPSCs 的多分化潜能来进行软骨细胞定向分化的研究少之又少；但是，随着组织工程化软骨技术的兴起，越来越多的学者开始重视iPSCs向软骨细胞转化研究。并进一步的阐明了iPSCs向软骨细胞分化的主要影响因素。细胞的生长环境直接影响软骨细胞的分化。研究表明，3D 环境对于软骨细胞的生长更为有利。Hwang NS 等[18，19]将细胞包被在水凝胶的研究证明了3D 环境更加适合软骨形成。诸多生长因子、细胞因子和分子信号都直接或间接的参与了软骨细胞分化的调节。Toh WS 等[20]研究表明BMP2 能显著提高软骨细胞的分化。在胚胎发育的过程中，Hargus G 等[21]研究阐明了SOX9 表达于软骨前体细胞和软骨细胞。Ikeda T 等[22]研究提示ES 细胞敲除SOX9 基因后会导致分化软骨细胞缺陷，而高表达SOX9 的非软骨组织可表达col-Ⅱ；Majumdar MK 等[23]研究表明白介素-1(IL-1)通过降低SOX9 和COL2a 表达，从而抑制软骨分化。Derfoul 等[24]通过基因转染技术，使鼠胚胎间充质系表达Wnt-3a，发现转染后的细胞碱性磷酸酶活性表达阳性，并且Wnt-3a 可显著抑制骨唾液蛋白、骨桥蛋白基因的表达。Runx2 家族[25]主要在骨软骨形成中，通过维持启动早期软骨细胞分化来促进软骨发生，是软骨细胞分化晚期的关键基因。

7. 诱导多能干细胞与间充质干细胞的比较

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、高度增殖和自我更新能力的多潜能干细胞。20 世纪六十年代Friedenstein等[26]在骨髓中首次发现，随着研究的不断深入，间充质干细胞还被发现存在于脐带血、胎盘、脂肪组织、骨膜、滑膜、肌肉、真皮组织等多种组织中，甚至在外周血[27]和牙周膜[28]中也发现了间充质干细胞的存在。MSCs 来源的多样性，一方面丰富了组织工程种子细胞的来源，但是另一方面也增加了临床应用的不确定性，不同组织来源的MSCs 在表型上可能不同，表型的不同可能直接关系到其发挥相应功能的潜力。MSCs 有多种功能，如抑制肿瘤，免疫调控，造血支持，多向分化潜能等，但是，由于MSC 有限的增殖代数，如何获取千万级的可用于组织工程的种子细胞数量，仍然是目前制约MSC 发展的最大瓶颈。而相比MSC 而言，iPS细胞不存在种子细胞数量不足的缺点，理论上其具备无限传代的能力，且目前已有研究表明，IPS 细胞在一定的条件下，可以向MSC 细胞转化。Gruenloh 等[29]报道来源于人ESCs 的MSCs 细胞，表现出与BMMSCs 类似的细胞表型，核型稳定，具备三向分化能力，并且动物实验表明其可以有效治疗肢端缺血动物模型；Lian 等[30]报道他们通过流式技术筛选出了CD24-CD105+ 细胞群，再通过单克隆筛选的方法，从这群细胞群里得出了具备MSC 功能的iPS-MSC 细胞克隆团，且得出的细胞端粒酶活性比BMSC 相比，要高出100 倍以上。

8. 诱导多能干细胞(iPSCs)向软骨细胞定向诱导分化的研究前景

尽管目前对于iPSCs 细胞系的建立在技术上已很成熟，但是重编程依旧是一个包含大量未知事件的缓慢而低效的过程，具体机制不明。iPSCs 的出现，让自体软骨或软骨细胞移植修复成为可能，但自体移植的过程并非简单可以完成的，需要大量的工作来完成，不管是时间上还是人力物力上，都消耗巨大。为了克服这一困难，建立起符合良好质量 标 准(Good manufacturing practice， GMP)的iPS 细胞库，是解决这一困难的最佳途径[31]。软骨组织的结构特异性，局部无血管神经的分布，故其免疫原性较低，在一定程度上可以接受同种异体移植而不会产生免疫排斥，iPS 细胞库将给今后同种异体软骨移植带来极大的便利。iPS 细胞作为理想的种子细胞，给干细胞研究带来了新的方向，同时也极大的推动了多能干细胞在临床应用方面的发展。利用iPSCs 可以获得病人自体来源的多能干细胞，不再担心使用胚胎干细胞时所遇到的伦理问题；通过构建疾病特异性iPSCs，可以用来研究各种疾病的发病机理以及筛选新的药物；利用iPSCs的多向分化潜能可以获得大量用于细胞替代治疗的种子细胞。 目前，已经有很多关于疾病特异性iPSCs 的报道。例如帕金森症、肌萎缩性侧索硬化症等神经性疾病，地中海贫血症、镰刀型贫血症等血液性疾病，糖原储积症、肝豆状核变性、I 型糖尿病等代谢性疾病[32-39]。通过基因工程技术可以将这些疾病特异性iPSCs 的基因缺陷进行修复，然后用修复后的iPSCs 向功能细胞定向分化，即可获得功能正常的细胞进行细胞替代治疗[40]。综上所述，尽管目前对于iPS 细胞产生的具体机制尚不明确，定向软骨或软骨细胞分化的研究还不够深入，仍有许多问题亟待解决，但是，iPS 细胞技术的出现，无疑给干细胞的研究，再生医学的研究开辟了新的途径。

[1] Mithoefer K，Mcadams T，Williams RJ，et al. Clinical efficacy of the microfracture technique for articular cartilage repair in the knee: an evidence-based systematic analysis[J].Am J Sports Med，2009，37(10): 2053-2063

[2] Steadman JR，Rodkey WG，Briggs KK，et al. The microfracture technic in the management of complete cartilage defects in the knee joint[J]. Orthopade，1999，28(1): 26-32

[3] Gurdon J. The developmental capacity of nuclei taken from differentiating endoderm cells of Xenopus laevis[J].Journal of embryology and experimental morphology，1960，8(4):505-526

[4] Gurdon J. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells[J]. Developmental biology，1962，4(2):256-273

[5] Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J]. Nature，1997，385(6619):810-813

[6] Tachibana M，Amato P，Sparman M，et al. Human embryonic stem cells derived by somatic cell nuclear transfer[J]. Cell，2013，153(6):1228-1238

[7] Tada M，Tada T，Lefebvre L，et al. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells [J]. The EMBO journal， 1997， 16 (21):6510-6520

[8] Takahashi K，Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J]. Cell，2006，126(4):663-676

[9] Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J]. Cell，2007，131(5):861-872

[10] Yu J， Vodyanik MA， Smuga-Otto K， et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells[J]. Science，2007，318(5858):1917-1920

[11] Medvedev SP，Grigor' Eva EV，Shevchenko AI，et al. Human induced pluripotent stem cells derived from fetal neural stem cells successfully undergo directed differentiation into cartilage [J]. Stem Cells and Development， 2011， 20 (6):1099-1112

[12] Koyama N，Miura M，Nakao K，et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells[J]. Stem Cells and Development，2013，22(1): 102-113

[13] Toh WS，Lee EH，Guo XM，et al. Cartilage repair using hyaluronan hydrogel-encapsulated human embryonic stem cell-derived chondrogenic cells[J]. Biomaterials，2010，31(27): 6968-6980

[14] Park S，GI Im. Embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells for skeletal regeneration[J]. Tissue Eng Part B Rev，2014，20(5): 381-391

[15] Oldershaw RA，Baxter MA，Lowe ET，et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes[J]. Nature Biotechnology，2010，28(11): 1187-1194

[16] Johnstone B，Hering TM，Caplan AI，et al. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells[J]. Experimental Cell Research，1998，238(1): 265-272

[17] Barry F，Boynton RE，Liu B，et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: Differentiation-dependent gene expression of matrix components[J]. Experimental Cell Research，2001，268(2): 189-200

[18] Hwang NS，Varghese S，Zhang Z，et al. Chondrogenic differentiation of human embryonic stem cell-derived cells in arginine-glycine-aspartate-modified hydrogels [J]. Tissue Eng，2006，12(9): 2695-2706

[19] Hwang NS，Kim MS，Sampattavanich S，et al. Effects of three-dimensional culture and growth factors on the chondrogenic differentiation of murine embryonic stem cells[J].Stem Cells，2006，24(2): 284-291

[20] Toh WS，Yang Z，Liu H，et al. Effects of culture conditions and bone morphogenetic protein 2 on extent of chondrogenesis from human embryonic stem cells[J]. Stem Cells，2007，25(4): 950-960

[21] Hargus G，Kist R，Kramer J，et al. Loss of Sox9 function results in defective chondrocyte differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro[J]. Int J Dev Biol，2008，52(4):323-332

[22] Ikeda T，Kamekura S，Mabuchi A，et al. The combination of SOX5，SOX6，and SOX9 (the SOX trio) provides signals sufficient for induction of permanent cartilage[J]. Arthritis Rheum，2004，50(11): 3561-3573

[23] Majumdar MK，E Wang， EA Morris. BMP-2 and BMP-9 promotes chondrogenic differentiation of human multipotential mesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1[J]. J Cell Physiol，2001，189(3): 275-284

[24] Derfoul A，Carlberg AL，Tuan RS，et al. Differential regulation of osteogenic marker gene expression by Wnt-3a in embryonic mesenchymal multipotential progenitor cells[J].Differentiation，2004，72(5): 209-223

[25] Smith N，Dong Y，Lian JB，et al. Overlapping expression of Runx1(Cbfa2) and Runx2(Cbfa1) transcription factors supports cooperative induction of skeletal development[J]. J Cell Physiol，2005，203(1): 133-143

[26] Friedenstein AJ，Piatetzky-Shapiro II，Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells[J]. J Embryol Exp Morphol，1966，16(3):381-390

[27] 刘世森，苏 方，刘洪臣，等. 外周血作为骨组织工程种子细胞来源的初步研究[J]. 口腔颌面修复学杂志，2009，10(3):132-135

[28] 贺慧霞，刘洪臣，马军利，等. 牙周膜干细胞用于犬牙槽嵴组织工程化增高的实验研究[J]. 中华老年口腔医学杂志，2013，11(4):199-204

[29] Gruenloh W，Kambal A，Sondergaard C，et al. Characterization and in vivo testing of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells[J]. Tissue Eng Part A，2011，17(11-12):1517-1525

[30] Lian Q，Zhang Y，Zhang J，et al. Functional mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells attenuate limb ischemia in mice[J]. Circulation，2010，121(9):1113-1123

[31] Turner M，Leslie S，Martin NG，et al. Toward the development of a global induced pluripotent stem cell library[J].Cell Stem Cell，2013，13(4): 382-384

[32] Soldner F，Hockemeyer D，Beard C，et al. Parkinson' s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors[J]. Cell， 2009， 136 (5):964-977

[33] Dimos JT， Rodolfa KT， Niakan KK， et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons [J]. science，2008，321(5893):1218-1221

[34] Ebert AD，Yu J，Rose FF，et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient[J]. Nature，2009，57(7227):277-280

[35] Ye L，Chang JC，Lin C，et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(24):9826-9830

[36] Ghodsizadeh A，Taei A，Totonchi M，et al. Generation of Liver Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells Along with Efficient Differentiation to Functional Hepatocyte-Like Cells [J]. Stem Cell Rev Rep， 2010， 6 (4):622-632

[37] Rashid ST，Corbineau S，Hannan N，et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells[J]. Journal of Clinical Investigation，2010，120(9):3127-3136

[38] Zhang S，Chen S，Li W，et al. Rescue of ATP7B function in hepatocyte-like cells from Wilson' s disease induced pluripotent stem cells using gene therapy or the chaperone drug curcumin[J]. Human molecular genetics，2011，20(16):3176-8317

[39] Maehr R，Chen S，Snitow M，et al. Generation of pluripotent stem cells from patients with type 1 diabetes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(37):15768-71573

[40] Hanna J，Wernig M，Markoulaki S，et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin[J]. Science，2007，318(5858):1920-1923