干细胞技术与牙齿再生的研究进展

刘晓，何颖综述，朴正根审校

（暨南大学医学院口腔系广东广州510632）

·综述·

干细胞技术与牙齿再生的研究进展

刘晓，何颖综述，朴正根审校

（暨南大学医学院口腔系广东广州510632）

牙齿是一个复杂的生物器官，由多种组织组成，包括牙釉质、牙本质、牙骨质和牙髓，牙齿脱落是最常见的器官衰竭［1］。牙齿及其支持组织是由上下颌突和额鼻突的外胚层及外胚间叶细胞发育而来，其发育是一个长期、复杂的生物学过程，包括细胞与细胞、上皮与间充质的相互作用，细胞分化，形态发生，组织矿化和牙齿的萌出，而牙胚的分化和发育过程是依赖于特定牙齿发生部位的上皮组织及其下方的间充质组织相互作用而形成的，故对于再生的牙齿来说，其发育至少需要两种细胞，即牙源性上皮细胞及牙源性间充质细胞，而牙齿再生研究的方向多半是寻找这两种细胞的替代物。

干细胞是一类特殊的细胞，其生物学特征既具有自我更新的能力，又具有多向分化的潜能，可以在机体生命过程中无限期分裂，并在合适的条件或给予恰当的条件后，能分化产生多种不同的细胞类型；根据干细胞的不同发育阶段，目前可将其划分为：①胚胎干细胞；②成体干细胞，包括造血干细胞、骨髓间质干细胞、肌肉干细胞、脂肪干细胞等。某些干细胞可定向分化，发育成熟为一种特定细胞或限于某种功能的细胞，如：心肌细胞、皮肤细胞、神经细胞等；某些干细胞定向性不强，但具有分化成多种类型细胞的潜能［2］。干细胞技术，又称为再生医疗技术，是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。本文就几个典型的干细胞在牙齿再生中的应用作一综述，为牙齿再生研究提供新的思路。

1　胚胎干细胞与牙齿再生

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESc）是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有一种内在的自我更新能力并能分化成各种各样的功能性组织细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性［3］。无论在体外还是体内环境，ESc都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。人类ESc是由美国生物学家Thomson［4］第一次所分离出来。ESc是一种多能性细胞，来源于三个胚胎层的衍生物。考虑到未来的临床应用，ESc可分化为神经元，心肌细胞和许多其他类型的细胞［5］。大量的研究证明小鼠的ESc可以分化为心肌细胞、造血细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞［6-10］等。在上皮分化方面，ESc可分化为角膜上皮细胞、肾上皮细胞、色素上皮细胞［11-13］等。人类ESc对于人类疾病的细胞治疗也有着巨大的潜力，如：糖尿病，神经元退化性紊乱等［14］。

ESc在牙齿再生方面的研究早期主要是集中在诱导其形成神经嵴样细胞，由于其广泛的潜力，已有成功从人类ESc中产生出神经嵴样细胞的报道，神经嵴样细胞已成为一个研究干细胞生物学和疾病发展的理想的模型系统［15］。神经嵴细胞是一个多能的ESc细胞群，它对颅面部的各种结构包括牙齿的形成有重要作用，现在已经普遍认为牙釉质是它外胚层的衍生物，而牙髓牙本质复合体以及其周围的支持组织是源自神经嵴细胞衍生物的间质［16］。故ESc对于牙齿的形成与再生有着重要的意义。而ESc对于牙周组织的再生也有重要作用，牙周组织需要牙根表面新的牙骨质的形成，新的牙槽骨以及能使两矿化组织之间进行功能连接的牙周韧带纤维［17-18］。

上皮和间充质是牙齿器官再生所需的组分。有研究表明，小鼠的ESc和小鼠骨髓细胞可以分化为成釉样细胞。这些小鼠干细胞的研究表明，人类ESc可成为牙源性上皮细胞再生的一个可行的细胞来源。研究的确定因素包括了人牙源性间质可以促进ESc来源的上皮细胞进一步分化，并将进一步促进ESc在牙齿组织再生中的作用［19］。研究者Fang Ning［20］开发了一种有效的培养方式诱导小鼠ESc分化为牙源性上皮细胞。通过将小鼠ESc放入无造釉细胞血清培养液中培养，可以诱导分化出牙源性上皮细胞；并可观察到将小鼠ESc植入免疫功能不全小鼠中会显示出组织再生的能力，形成牙源性上皮样结构。还有国内学者Jiang［21］研究通过在体外将ESc诱导分化为成牙本质样细胞，发现将ESc诱导分化为拟胚体后，再将拟胚体细胞与牙髓成纤维细胞共培养，可以促进拟胚体细胞向成牙本质样细胞分化。

从理论上讲，ESc比ASc更具有分化潜能，在一定的诱导条件下，即可发育分化为所有组织器官具有特定功能的细胞，这一成就将会给移植治疗、药物的发现与筛选、基因治疗和生物发育等基础研究等带来深远的影响，打开在体外生产人体所有类型可供移植治疗的细胞、组织乃至器官的大门［22］。但是ESc的伦理争议，在疾病治疗中存在的免疫排斥问题以及形成畸胎瘤的风险制约着它的应用。

2　诱导多能干细胞与牙齿再生

随着干细胞技术的发展，早在2006年，日本的两位科学家KazutoshiTakahashi和Shinya Yamanaka［23］发现向小鼠皮肤成纤维细胞里转入四个基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）后，这些细胞能被诱导成为具有ESc特征的细胞，因其具有多能性，能分化产生体内任何类型的细胞，故称之为诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPSc）。其具有自我复制、自我更新和多向分化的能力，现已有研究证实，iPSc可以向人体内三个胚层的细胞分化，如外胚层分化为神经细胞、中胚层分化为心血管和造血细胞、内胚层分化为肝、肾等细胞。至此，揭开了体细胞重编程的序幕，即从任何一个胚层发育分化而来的细胞都可重编程成为iPSc，而且不同阶段的细胞重编程的难易程度不同［24］。由于安全、易获取以及有大量的细胞来源，外周血的使用促进了iPSc的研究。现在iPSc已经被用于细胞疗法，疾病模型和药物发现。小鼠iPSc能够分化成任何类型的细胞，甚至具有种系传播的能力［25］。这一技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了ESc的伦理争议，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。

随着iPSc研究在医学各个领域的兴起和发展［26-28］，2009年以来口腔医学领域也开始关注iPSc。现在把成体牙源细胞诱导成iPSc的技术相对成熟，Oda等［29］从拔牙后被丢弃的智齿中得到间充质干细胞，通过反转录OCT3/4，SOX2，KLF4这三个基因而获得了iPSc，在不使用原癌基因c-Myc基因的情况下，其产生的效率高于皮肤的成纤维细胞，使得这一研究在获得iPSc上又有了新的突破。另外，Xing Yan等［30］把牙齿干细胞，如：脱落乳牙干细胞、根尖牙乳头干细胞和牙髓干细胞进行细胞核重组而诱导成iPSc，因牙髓干细胞和脱落乳牙干细胞能低水平地表达与胚胎干细胞有关的基因，故和诱导成纤维细胞相比，显示出更高的效率。人牙龈纤维细胞和牙周膜纤维细胞衍生出的iPSc与人ESc表现出相似的特性，这些结果说明牙龈纤维细胞、牙周膜纤维细胞［31］、口腔黏膜纤维细胞［32］也可被诱导成iPSc。许多类型的细胞已经成功地在鼠身上完成了向iPSc的重组；然而重组人类细胞却变得更加困难。

近年来，iPS牙向分化及参与牙齿再生的研究成果开始被相继报道，iPSc在适当的条件下可分化为神经嵴样细胞［33］，它能表达诸如STRO-1、Lhx6和Msx1等牙源间充质干细胞的标志，通过与鼠牙源性上皮的相互作用神经嵴样细胞可诱导分化为牙源性间充质细胞（主要是成牙本质前体细胞），从而显现出iPSc在牙齿再生方面的潜能，但是相对于ESc，iPSc存在着分化效率低的问题。通过iPSc与牙源性上皮细胞的相互作用，可诱导其分化为表达p63、CK14和成釉蛋白的上皮［34］，这是第一次报道iPSc通过与牙源性上皮交互作用而分化为成釉细胞。但是，目前这些研究成果仍停留在相关标记分子的检测阶段，未真正获得再生牙。然而，Cai［35］课题组最新的研究结果显示，尿液来源的iPSc经过BMP-4、RA诱导后能形成表达p63的上皮组织，将上皮组织与鼠的间充质重组形成的重组牙胚移植入肾包膜下后能形成完整牙齿，这是首例运用iPSc产生再生牙。虽然在文章中提及有牙齿产生的概率问题，但iPSc在牙再生中的应用已开始崭露头角，其应用前景不容小觑。

iPSc的来源更方便、更丰富，可以通过有限的几个转录因子转染并直接诱导胎儿、新生儿和成年动物或人的体细胞来获取多能性干细胞。其次，iPSc的产生再也不需要早期胚胎或者其他配子的参与，克服了使用传统方法的伦理问题，可见iPSc必然成为未来相当长一段时间内的研究热点［36］。由于iPSc具有与ESc相类似的特性和功能，其成功地绕开了免疫排斥问题和伦理道德问题的困扰，是再生医学理想的种子细胞，也可作为临床药物筛选细胞模型和人类疾病治疗细胞模型［37］。

3　成体干细胞与牙齿再生

成体干细胞（adult stem cell，ASc）指存在于发育成熟机体组织中的具有高度自我更新和分化潜能的未分化细胞，ASc具有自我更新，不断增殖和分化转移的能力，它有广泛的来源，不涉及伦理问题。ASc在组织工程中将起到非常重要的作用，如在医学领域的修复，重建以及神经组织的再生［38］。目前已在几乎所有机体组织中发现ASc的存在，其特有的生物学特性及潜在的生物医学价值，使之成为近年来生物学及生物医学领域中最受关注的热点课题之一。ASc定位在特定的器官可以分化成巨噬细胞和骨细胞等功能性实体，造血干细胞和间充质干细胞是两种最重要的ASc，它们有能力去通过血液循环、迁移到损伤部位以及增强再生的过程［39］。

ASc与牙髓、牙齿的再生，Ishizeki［40］将完整分离的鼠牙牙髓移植于脾脏，发现40d后有类似于天然的管状牙本质形成，尚有骨性牙本质的形成；而Yamada［41］将25d鼠牙胚体外连续培养10d，结果形成了牙本质和釉质的细胞外基质。ASc与牙周组织再生，不少学者认为牙周膜是一个自我更新的系统，存在原始的能产生不同表型的干细胞或称为牙周膜前体细胞，这种干细胞就是牙周膜干细胞，它具有不定向分化潜能，在不同的生长因子微环境条件下，可分化为成牙骨质细胞、牙周膜成纤维细胞及成骨细胞，分别形成牙骨质、牙周膜和牙槽骨，是牙周组织工程化理想的种子细胞。牙髓干细胞［42］（dental pucp stem cells，DPSCs）是一种成体干细胞，DPSCs重要的特征之一是一定条件下能形成牙本质牙髓复合体，这将为其应用于组织工程中重建牙本质牙髓复合体展示了巨大的优越性和可行性，也为其在牙髓生理、病理、牙髓病生物治疗方面的研究提供了重要的应用价值。

ASc由于具有较长期的自我更新能力，在一定条件下，可分化为不同类型的细胞，并形成相应的组织，被认为是组织工程与再生医学研究领域最有价值的种子细胞。不仅口腔来源的ASc作为组织工程的种子细胞，成功构建了牙本质、牙髓、牙周膜、牙骨质再生甚至全牙；而且其他组织起源的ASc，如：造血干细胞、骨髓基质细胞、皮肤干细胞、神经干细胞、血管内皮细胞、肌肉干细胞等也可能在口腔颌面部血管、骨、皮肤、神经、肌肉等组织的损伤与修复治疗中发挥重要作用。早在2005年，Modino和Sharpe［43］的实验就已表明，利用非牙源性的ASc是可以诱导牙的发生以及形成牙齿的，同时也指出可将发育中的牙胚成功植入到患者的牙龈中。目前对ASc研究的深入，尤其是ASc用于牙本质、牙髓、骨、软骨组织的再生，将为牙再生奠定可靠的基础。

ASc的优点，获取相对容易，源于患者自身的ASc在应用时不存在组织相容性的问题，避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂。理论上，ASc致瘤风险很低，而且所受伦理学争议较少，ASc还具有多向分化潜能。因此，人们对ASc在临床治疗中的应用寄予很高的期望［44］。

4　展望

目前，干细胞的研究几乎涵盖了基础与临床医学的各个领域。这一方面有助于我们认识细胞生长、分化和器官形成等基本生命规律，另一方面，也为治疗某些疾病开辟了一条新的途径。随着口腔医学日新月异的发展，干细胞在口腔方面的应用研究正在迅速深入开展。现在研究最多的就是上述的ESc，iPSc和ASc。

ESc具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，对于牙齿的形成与再生有着重要的意义。但由于ESc的获得和研究涉及到复杂的伦理问题，它的相关研究受到了极大的限制。ASc是具有高度自我更新和分化潜能的未分化细胞，在诱导牙的发生以及形成牙也有着举足轻重的作用。ASc因离成熟细胞近、来源广泛、可塑性强、无免疫排斥等优势，已展示了诱人的临床应用前景。ASc的研究进展也必将为口腔基础和临床研究打开新的突破口。

iPSc不仅在细胞形态、表面抗原、基因表达、增殖及分化潜能方面类似于ESc，而且，摆脱了围绕人类ESc使用问题的政治和伦理争论，避免了患者异体干细胞移植引起的免疫排斥反应等优点。iPSc仅仅出现了两年，便已在提高效率和应用到各种模式生物上取得了很大进展［45］。而且，Cai课题组最新的研究结果显示，尿液来源的iPSc经过BMP-4、RA诱导后能形成表达p63的上皮组织，将上皮组织与鼠的间充质重组形成的重组牙胚移植入肾包膜下后能形成完整牙齿，这是首例运用iPSc产生再生牙。这说明iPSc在牙再生中的应用已开始崭露头角，其应用前景不容小觑，其发展前景已逐见曙光。

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The research of stem cell technology in tooth regeneration

2015-04-07

2015-05-11

编辑/李阳利

注：刘晓、何颖均为暨南大学医学院口腔医学在读硕士

中国科学院广州生物医药与健康研究院再生生物学重点实验室开放课题资助（编号：KLRB201217）

朴正根，博士，副教授，硕士研究生导师；E-mail：pzg430@126.com