多发性肠系膜静脉栓塞患者易栓症的类型与遗传相关性

乔晓亮

（郑州市妇幼保健院检验科，河南　郑州　450003）

多发性肠系膜静脉栓塞患者易栓症的类型与遗传相关性

乔晓亮

（郑州市妇幼保健院检验科，河南郑州450003）

通过对多发性肠系膜静脉栓塞患者及其家系进行相关检查和基因诊断得出，易栓症相关检测结果及基因序列突变分析，患者与其弟弟有车祸外伤史等获得性诱因存在，但两患者间不存在AT基因突变，诊断为获得性易栓症。

多发性静脉血栓；易栓症；遗传基因

1　资料与方法

1.1一般资料

患者（Ⅱ2），男，汉族，32岁，于2008年因车祸致左侧髂骨及盆腔骨折，经术后休养，随后出现腹痛等症状，经血管造影与CT等检查诊断为肠系膜静脉血栓。于2012年底因右侧腹部剧烈胀痛再次入院治疗，行剖腹探查，发现结肠段肠系膜出现血栓栓塞。术后行溶栓治疗，出院后给予华法林维持治疗半年，每月监测凝血机制一次。患者弟弟（Ⅱ3），男，汉族，28岁，同在2008年车祸中导致两根肋骨骨折，2009年出现下肢肿胀疼痛，经多普勒彩超和CT检查发现右下肢存在静脉栓塞。该家系其他成员无静脉血栓史。

1.2相关检测指标

经所有成员同意后，对该家系成员（7人）分别采用静脉穿刺采集外周血，并留取晨尿标本各10 mL。干燥管及枸橼酸钠抗凝管血液样品，立即3000 r/min离心10 min。尿液样本进行尿液分析，血样进行PT、APTT、TT及FIB凝血四项、血液细胞分析和D-D二聚体检测、蛋白C的活性（PC:A）和蛋白S的活性（PS:A）以及AT的活性检测、血糖、肝肾功能、狼疮抗凝物（LA）及抗心磷脂抗体检测等。

1.3Western blot检测血浆中AT含量

从-80℃冰箱取出枸橼酸钠抗凝冻存的血浆，并将该家系7位成员的血浆用磷酸盐缓冲液稀释20倍，与上样缓冲液3：1混合，放到100℃沸水中煮沸5 min，使蛋白变性为蛋白单体。然后进行蛋白电泳（10%SDS-PAGE，60V，55 mA）3.5 h，再经湿转法进行转膜电泳（60 V，160 mA）3 h，使电泳后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上。以5%牛奶粉脱脂溶液（脱脂奶粉0.5 g，TBST 10 mL）封闭2 h，彻底洗净，用抗AT的一抗孵育过夜（4℃），经清洗后用二抗孵育2 h。经过彻底清洗后用DAB显色液显色15 min。同时进行-actin的内参照显色，阳性条带呈现棕色后加蒸馏水洗涤。图像采集使用美国ALPHA凝胶成像系统扫描拍照。采用彩色预染蛋白质Marker（11-180kD）标记蛋白质分子量。

1.4全基因组DNA抽提

取该家系7位成员外周血（枸橼酸钠抗凝）各200 uL，提取试剂盒选用欧盟Fermentas DNA提取全基因组DNA，按说明规范操作。

1.5PCR扩增及产物纯化

AT基因的7个外显子的扩增引物序列参照文献报道［1］，并使用Primer5引物设计软件进行优化设计［2］。PCR总体系为25 uL：引物终浓度为0.2 umol/L，模板DNA 50 ng，Taq酶为1.25U（北京TIANGEN），dNTP终浓度为0.25 mmol/L，MgCl2终浓度为1.5 mmol/L。反应条件：95℃预变性5 min，而后95℃30 s，57℃退火30 s（如此反复实验，第3外显子采用62℃退火，第5外显子采用60℃退火），72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10min。取PCR产物80ul，加入20 uL样缓冲液（loading buffer）（4:1）混合，进行琼脂糖电泳（18 g/L琼脂糖，含溴化乙锭）30min，应用美国ALPHA凝胶成像系统扫描拍照。将患者相应电泳条带在254 nm紫外灯下切取，进行PCR产物回收、纯化采用QIAquick Extracion Kit试剂盒。

1.6AT基因测序及突变分析

PCR纯化后产物，进行正反向测序。患者AT基因测序后的结果，使用BLAST在线工具与美国国家生物信息中心公布的AT基因标准序列进行比对，进行基因突变分析。

1.7排除FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变

对患者进行FV Leiden突变检测：引物选用F，5’CCATTATTTAGCCAGGAGACC3’，R，5’ATTGGTTCCAGCGAAAGC3’；除此之外，对外显子10以及侧翼序列扩增（60℃退火）和测序分析。并同时进行对凝血酶原G20210A突变检测：引物采用F，5’TCTAGAAACAGTTGCCTGGC3’，R，TCCAGTAGTATTACTGGCTC3’；对外显子14以及侧翼序列扩增（53℃退火）和测序分析。

2　结 果

2.1检测结果

患者（Ⅱ2）检测结果：AT：A 49%，PC：A 125%，PS：A 117%，PT 11.9s，INR 0.99，APTT 40.7 s，TT 15.5 s，FIB 2.89 g/L；血液细胞分析、肝肾功能等无明显异常，血糖、尿液分析、D-D二聚体、狼疮抗凝物、抗心磷脂抗体、同型半胱氨酸等检测结果均正常。患者（Ⅱ3）检测结果：AT：A 45%，PC：A 97%，PS：A 126%，其他检查正常。该家系7人中有2人表现为AT:A的降低，而其他成员的AT、蛋白C和蛋白S活性等检测结果均正常。

Western blot检测结果与AT抗原含量检测一致，仅表现为AT活性降低。

2.2测序结果及突变分析

将患者AT基因7个外显子测序后的结果与AT基因的标准序列进行比对和分析；用BLAST工具将测序序列转化成氨基酸序列，与美国国家生物信息中心公布的AT氨基酸序列进行比对，均未发现AT基因突变位点和氨基酸序列异常。

2.3FV Leiden突变和凝血酶原G20210A突变分析

对患者（Ⅱ2）的FV基因的第10外显子及凝血酶原基因的第14外显子进行产物测序和PCR扩增，未发现以凝血酶原G20210A突变及FV Leiden突变。

3　讨 论

该家系两个患者AT基因测序结果显示：患者（Ⅱ2）与患者（Ⅱ3）的PC:A、PS:A检测均正常可排除PS和PC蛋白异常的影响，肝肾功能、血糖、凝血四项、抗心磷脂抗体、LA、同型半胱氨酸和D-D二聚体等均正常可排除其他疾病的影响［3-4］，经基因突变分析未发现AT基因突变、凝血酶原G20210A突变和FV Leiden突变，仅有AT:A活性降低，而患者有骨折史、手术史是获得性易栓症发病的重要诱因。术后予患者抗凝、溶栓治疗2周，好转后每月监测一到三次凝血机制，出院后继续适当服用抗凝药物适量进行预防性用药半年［5］。

本文为获得性易栓症与遗传性易栓症的鉴别诊断提供了参考，为今后易栓症的深入相关研究提供了病例资料。

［1］ 张红媛，王谢桐.易栓症相关自身抗体的研究进展［J］.中华产科急救电子杂志，2014（02）:70-72.

［2］ 李正民，吕金利，方盼盼，等.抗凝血酶基因10381T缺失导致的Ⅰ型抗凝血酶缺乏症.基础医学与临床，2014，05（03）.

［3］ 王谢桐，李善玲.孕产期易栓症与肺栓塞的诊治［J］.实用医院临床杂志，2013（02）:16-23.

［4］ 张 蕾，付锦华，曹双元.血中狼疮抗凝物的含量与自然流产的关系［J］.中外医学研究，2011（01）:17-18.

本文编辑：徐 陌

Type and genetic correlation of embolism in patients with multiple mesenteric venous thrombosis

QIAO Xiao-liang
（Maternal and child health care hospital of Zhengzhou City，Henan Zhengzhou 450003，China）

R657.2

B

ISSN.2095-6681.2015.24.116.02

乔晓亮（1982-），男，河南安阳人，本科，主管检验师，研究方向：医学检验